劉 妮 李淑華 梁英杰 楊詩聰

（中山大學附屬第一人民醫(yī)院病理科 廣州510080）

免疫組化技術在病理診斷中起著十分重要的作用，但前提是要有穩(wěn)定和高質(zhì)量的免疫染色結(jié)果［1］。然而免疫組化的染色過程比較復雜，影響染色結(jié)果的因素也很多［2］，所以設置免疫組化對照尤為重要。本實驗研究在多種不同類型的組織中找出合適的免疫組化陽性對照及其相關制作方法。

材料和方法

1.材料

選取中山大學附屬第一醫(yī)院送檢的闌尾、乳腺和扁桃體組織，10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片厚4μm。

2.方法

選取的組織通過HE染色觀察，根據(jù)合適相應抗原表達的區(qū)域，將各組織切成0.3cm×0.3cm大小進行再包埋，保證各組織包埋面含有相應的組織成分，如闌尾組織應含有粘膜層，粘膜下層，肌層和外膜等結(jié)構(gòu)。將闌尾、乳腺和扁桃體組織分成A、B、C三組，分別進行36種抗體的全自動免疫組化染色，其中標記上皮相關抗原的抗體有CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、M－CEA、EMA，標記肌源性抗原的抗體有SMA、HHF35、Calponin，標記神經(jīng)來源的抗體有 Vimentin、S－100、NSE、CD56，標記血管及淋巴管內(nèi)皮的抗體有 CD31、CD34、D2－40、FactorⅧ，淋巴瘤相關抗體有LCA、CD20、CD79a、CD3、CD5、CD10、CD21、CD23、CD4、CD8，乳腺癌標記相關抗體有ER、PR、Ki67，組織細胞來源相關抗體有CD68，Mac387，AAT，AACT，Lyosozyme。

結(jié) 果

A組：闌尾組織中 CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、M－CEA、EMA在腺上皮胞漿呈陽性（圖1）；SMA、HHF35、Calponin顯示為肌層肌纖維胞漿陽性（圖2）；Vimentin顯示為間葉組織胞漿陽性；S－100、NSE、CD56為肌層神經(jīng)纖維陽性（圖3）；CD31、CD34粘膜下層血管內(nèi)皮陽性；D2－40、FactorⅧ為淋巴管內(nèi)皮陽性；LCA、CD20、CD79a、CD10淋巴細胞陽性，CD21、CD23在固有層的淋巴小結(jié)濾泡生發(fā)中心的樹突狀細胞胞膜呈陽性；CD3、CD4、CD5、CD8則在濾泡周圍的淋巴細胞呈陽性表達（圖4）。CD68、Mac387、Lyosozyme、AAT、AACT在粘膜下層散在的組織細胞胞漿陽性；Ki67在淋巴小結(jié)濾泡中心顯示為細胞核陽性。共34種抗體染色陽性。

圖1 CK腺上皮胞漿陽性10×圖2 Calponin平滑肌纖維胞漿陽性10×圖3 S－100神經(jīng)纖維胞漿陽性10×圖4 CD3濾泡周圍淋巴細胞胞膜陽性20×圖5 免疫組化染色片F(xiàn)ig.1 Glandular epithelial cells show positive staining of CK in the cytoplasm.10×Fig.2 Smooth muscle fibers show positive staining of Calponin in the cytoplasm.10×Fig.3 Nerve fibers show positive staining of S－100 in the cytoplasm.10×Fig.4 Follicular peripheral lymphocytes show positive staining of CD3 in the cytomembrane.20×Fig.5 The slide of immunohistochemical staining

B組：乳腺組織中 CK、CK8／18、CK19、CK20、CK－LMW、EMA 在 導 管 上 皮 呈 陽 性；SMA、HHF35、Calponin顯示為肌上皮細胞和平滑肌纖維陽性；Vimentin顯示為間葉組織胞漿陽性；CD31、CD34血管內(nèi)皮陽性；D2－40、FactorⅧ淋巴管內(nèi)皮陽性；ER、PR、Ki67在導管上皮細胞核陽性，其余為陰性染色。共17種抗體染色陽性。

C組：扁桃體組織中CK、CK8／18、EMA在上皮細胞胞漿呈陽性；血管肌層陽性的有SMA、H HF35、Calponin，Vimentin顯示為間葉組織胞漿陽性，CD31、CD34血管內(nèi)皮陽性；D2－40、FactorⅧ淋巴管內(nèi)皮陽性，LCA、CD20、CD79a、CD10、CD21、CD23在淋巴結(jié)濾泡生發(fā)中心顯示為淋巴細胞胞膜陽性；CD3、CD4、CD5、CD8在濾泡周圍副皮質(zhì)區(qū)淋巴細胞呈陽性表達。共21種抗體染色陽性。

討 論

免疫組織化學技術在病理診斷中是把雙刃劍，高質(zhì)量的免疫組化染色結(jié)果能輔助病理醫(yī)生更準確地進行病理診斷，提過病理診斷水平；但不當?shù)拿庖呓M化染色結(jié)果可能會引起漏診和誤診甚至造成錯誤的病理診斷，而免疫組織化學染色過程中，經(jīng)過多個步驟的操作，每一個步驟操作不當都會影響染色結(jié)果進而影響病理診斷的準確性［3］。特別是全自動免疫組化機越來越普及，在使用全自動免疫組化染色機染色時，無從觀察到染色的全過程，如果出現(xiàn)切片上抗體量不足或有氣泡等現(xiàn)象也無法避免。因此，進行免疫組化染色質(zhì)控，確保染色結(jié)果穩(wěn)定可靠十分重要。在染色過程中設立對照是進行染色質(zhì)控的重要措施之一，能保證免疫染色過程中抗體試劑可靠，染色操作正確，避免試劑失效，操作失當或機器故障引起假陽性或假陰性的結(jié)果。對照組織一般預先切片貼在載玻片中央保存，需要時再將待檢測組織切片貼在對照組織旁邊（圖5），使待檢測試組織片和對照片都在同一張玻片中，在相同的條件下，進行免疫組化染色。在觀察染色結(jié)果時，應首先觀察對照組織片的染色結(jié)果，通過對照片的結(jié)果來判斷該片免疫組化染色是否成功。如果對照片染色結(jié)果抗原表達正確，沒有非特異性染色，則該片中待檢測組織的染色結(jié)果就可靠，可用于病理診斷.如果對照片染色不當，出現(xiàn)非特異性染色，那么該待檢組織片就不能用于診斷，需要找出染色不當?shù)脑?，重新進行染色。

目前，國內(nèi)外很多單位多使用組織芯片作為對照［4，5］。但組織芯片中有多個組織才能滿足幾十種抗體對照的需要，所占的面積較大，所需的抗體也較多，而且制作組織芯片麻煩，也經(jīng)常出現(xiàn)某一個組織掉片的現(xiàn)象，購買商品化的組織芯片成本高［6］。本實驗選取闌尾組織作為對照組織，較其他組織闌尾組織所包含的組織細胞種類多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管等，大部分常用的抗體都分別在相應的組織細胞中表達或不表達，因此最適合用于制作免疫染色的對照片。而且闌尾作為陽性對照的制作方法也比較簡便，正常闌尾管腔小，只需將呈管狀組織的闌尾組織，沿管徑切成0.3cm×0.3cm大小的扇形闌尾，使其含有粘膜層、粘膜下層、肌層和外膜，保證組織含有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管等組織細胞，再包埋成0.4cm×0.4cm大小的組織蠟塊。這樣制作對照片，標本來源容易，制作簡單，可節(jié)約人力、物力，也十分適合基層醫(yī)院開展工作。

用作對照的組織蠟塊和石蠟切片，不適宜長期保存，因存放時間過長，組織抗原的保存受到一定的影響，抗原活性會有所降低，因此組織蠟塊保存于數(shù)月后應放棄使用，重新找新的組織制作蠟塊，而闌尾組織較容易獲得，材料來源十分方便。另外切好的對照片一般在室溫晾干過夜，此時，組織蠟片沒有熔開，可保存長一些時間，待貼上待檢測組織片時，再一起烤片。切片的數(shù)量按平時的工作量作為依據(jù)，一般可供使用一星期為佳，不宜大量切片，過長時間保存。闌尾組織作為對照組織也有一定局限性，對于某些抗體染色，闌尾組織并都不適用，需要另外選取相應的對照組織片，如ER、PR等抗體染色的陽性對照，則應選用含正常導管上皮的乳腺導管癌組織片做對照。

綜所上述，我們認為闌尾組織較其他單一組織，可用于更多種抗原的染色對照，較組織芯片制作更簡單，操作更方便，成本更低，所耗費的試劑更少，因此最適合用來制作免疫組化染色的質(zhì)控對照片，值得推廣使用。

［1］李麗華，病理免疫組化染色方法質(zhì)量控制應注意的問題.局解手術學雜志，2008，（06）：434－435

［2］李德本，王濤，姜駿.免疫組化染色的操作技巧和注意事項.臨床與實驗病理學雜志，2011，（11）：1260－1261

［3］梁英杰，凌啟波，張威.臨床病理學技術.北京：人民衛(wèi)生出版社.2011：292

［4］劉衛(wèi)平等，組織芯片技術及其在病理學研究中的初步應用.中華病理學雜志，2002，（02）：83－84

［5］Sallinen SL.Identification of differentially expressedgenes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques.Cancer Res，2000，60（23）：6617－6622

［6］景青萍，張建中，鄭燕華，等.微組織芯片在免疫組化染色對照實驗中的應用.診斷病理學雜志，2005，（02）：154－155