田 野 徐 瑩 付 勤

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)骨科，1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng)110004）

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨贅形成為特征的退變性疾病，患肢關(guān)節(jié)經(jīng)常出現(xiàn)嚴(yán)重的疼痛，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能降低，對(duì)病人的生存質(zhì)量造成明顯的影響［1］。近幾年的研究表明，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞和骨骺軟骨生長(zhǎng)板內(nèi)的細(xì)胞一樣，都要經(jīng)歷終末期成熟分化的過(guò)程［2］；對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的治療，則以抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的病理生理過(guò)程，即以抑制其終末期成熟分化為基礎(chǔ)［3］。本研究以新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞為細(xì)胞模板，探索甲狀旁腺素（PTH）是否對(duì)其具有促進(jìn)成軟骨和抑制其終末期成熟分化的作用。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

昆明新生小鼠（出生4日內(nèi)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；1－34重組人甲狀旁腺素（Sigma公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS，Hyclone）；鏈霉蛋白酶和二型膠原酶（上海艾研生物科技有限公司）；Alcian藍(lán)染色試劑（Sigma公司）；ALP 染色 one－step試劑（Pierce 公司）；RNeasy試劑盒（Qiagen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen 公 司）；SYBR Green（Applied Biosystems公司）；ALP兔抗鼠單克隆抗體（santa cruz biotechnology公司）；Runx2兔抗鼠單克隆抗體（abcam公司）；Sox9和Aggrecan兔抗鼠單克隆抗體（santa cruz biotechnology公司）；β－actin兔抗鼠單克隆抗體（Sigma公司）。

2.方法

2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng)：分離新生小鼠的胸骨和肋骨，PBS沖洗1次，加入鏈霉蛋白酶（2mg／ml），37℃水浴震蕩1h；PBS沖洗3次，加入二型膠原酶（3mg／ml），37℃水浴震蕩1h；PBS沖洗3次，將消化剩余物移入表面皿中，再次加入二型膠原酶（3mg／ml），置于孵育箱內(nèi)4－6h，每隔1h震蕩一次；通過(guò)0.7μm過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾過(guò)液，1200rpm離心5m，收集沉淀，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞種植于6孔或12孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞分組和處理：將細(xì)胞分為兩組：鹽水對(duì)照組和PTH處理組，于種植后24h，開(kāi)始用生理鹽水或PTH（100n M）每日處理細(xì)胞。每日觀察細(xì)胞形態(tài)，并于第3－7日間，每日收集細(xì)胞進(jìn)行染色、RT－PCR和Westernblot等實(shí)驗(yàn)。

2.3 Alcian藍(lán)染色：吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，于室溫下以10%中性福爾馬林固定細(xì)胞20min；吸除福爾馬林，PBS清洗2次，加入Alcian藍(lán)染色劑（p H2.5），室溫下孵育2h；吸除染色劑，70%乙醇清洗細(xì)胞2次，去離子水清洗細(xì)胞3次，室溫下自然干燥過(guò)夜。

2.4 堿性磷酸酶（ALP）染色：吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，于室溫下以10%中性福爾馬林固定細(xì)胞15min；吸除福爾馬林，PBS清洗2次，加入ALP one－step染色劑，于37℃孵育45min；吸除染色劑，PBS清洗2次，室溫下自然干燥過(guò)夜。

2.5 RNA 提 取 和 實(shí) 時(shí) RT－PCR（Real－time RT－PCR）：用RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后稀釋3倍，取1μl稀釋后的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。特異性小鼠引物序列如下：ALP：Sense：TGACCTTCTCTCCTCCATCC，Antisense：CTTCCTGGGAGTCTCATCCT； Runx2：Sense： GGAATGATGAGAACTA，Antisense：ACCGTCCACTGTCACTTT；Sox9：Sense：CTAATGCTATCTTCAAGGCGCTGC， Antisense： CTCGCTTCAGATCAACTT TGCCAG；Aggrecan：Sense：CGTGTTTCCAGAGAAAAGGA， Antisense：TGTGCTCGATCAAAGTCCAG；β－actin：Sense：AGATGTGGATCAGCAAGCAG； Antisense：GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA.反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15min后，95℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共45個(gè)循環(huán)，于72℃延伸階段檢測(cè)熒光產(chǎn)物，生成擴(kuò)增曲線(xiàn)。在同一次反應(yīng)中，各組均設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。以β－actin為內(nèi)參基因，通過(guò)Rotor Gene分析軟件進(jìn)行定量分析。

2.6 Western Blot檢測(cè)蛋白：以Golden lysis buffer液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每泳道上樣40μg，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入一抗（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加入二抗（1∶3000）室溫下孵育1h。以β－actin為內(nèi)參基因，Supersignal west Pico試劑孵育10分鐘，曝光20s，照相并分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)以均數(shù)＋標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞的分化特征

未經(jīng)處理的新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞的ALP染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng) （圖1）；成軟骨因子基因表達(dá)逐漸減弱，促病理性肥大基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖2）。以上結(jié)果表明，新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞具有自發(fā)性成熟分化的特點(diǎn)。

2.PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

未經(jīng)處理的新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞于種植后24小時(shí)貼壁生長(zhǎng)，于5天達(dá)到80%－90%融合，之后細(xì)胞開(kāi)始逐漸失去軟骨細(xì)胞形態(tài)。但與對(duì)照組相比，經(jīng)PTH處理后，于5－7天細(xì)胞融合后，細(xì)胞仍更多的保持軟骨細(xì)胞形態(tài) （圖3）。

3 PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞Alcian藍(lán)染色和ALP染色的影響

對(duì)照組新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞Alcian藍(lán)染色強(qiáng)度，隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸減弱；經(jīng)PTH處理組染色強(qiáng)度，隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，且于第5、6和7日，與對(duì)照組相比，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖4）。兩組新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞ALP染色強(qiáng)度，均隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，但PTH組與對(duì)照組相比增強(qiáng)緩慢，于第5、6和7日，PTH明顯降低了ALP的染色強(qiáng)度，二者比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖5）。

4.PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞成軟骨和促病理肥大因子基因m RNA表達(dá)的影響

對(duì)照組和PTH組新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞Sox9和Aggrecan基因的表達(dá)，均隨時(shí)間逐漸下降；但在每一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，PTH均明顯提高細(xì)胞內(nèi)Sox9和Aggrecan基因的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，兩組細(xì)胞內(nèi)ALP和Runx2基因的表達(dá)，均隨時(shí)間逐漸升高，但與對(duì)照組相比，PTH組ALP和Runx2基因表達(dá)升高幅度較緩，在每一時(shí)間點(diǎn)，PTH均明顯降低二基因的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。

5.PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞成軟骨和促病理肥大因子蛋白表達(dá)的影響

與其基因表達(dá)一致，與對(duì)照組相比，PTH顯著提高細(xì)胞內(nèi)Sox9和Aggrecan蛋白的表達(dá)，顯著降低細(xì)胞內(nèi)ALP和Runx2蛋白的表達(dá)（圖7）。

討 論

人類(lèi)甲狀旁腺素（PTH）是含有84個(gè)氨基酸的多肽蛋白，具有調(diào)節(jié)血鈣、血磷，維持細(xì)胞外液內(nèi)環(huán)境的重要作用，其人工合成體PTH（1－34），含有34個(gè)PTH N端氨基酸序列相似分子片段，這一部分能夠與PTH受體結(jié)合而發(fā)揮相同的生物學(xué)作用［4－6］。在體實(shí)驗(yàn)表明，PTH（1－34）能夠抑制大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展，但是具體的細(xì)胞學(xué)機(jī)制不甚明了［7］。

本研究表明，新生小鼠的胸骨軟骨細(xì)胞具有自發(fā)性成熟分化的特征，正如前述，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞也具有向終末期成熟分化的特征。因此新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞的部分生物學(xué)特征與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞極為相似，我們以此為依據(jù)，探索PTH（1－34）是否對(duì)離體軟骨細(xì)胞具有抑制終末期分化的作用。

近年來(lái)的研究結(jié)果證實(shí)，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞經(jīng)歷了終末期、病理肥大分化和基質(zhì)分泌減少的病理生理過(guò)程［8］。對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的治療研究，可以基于抑制軟骨細(xì)胞終末期、病理肥大分化和促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)形成兩方面［9］。在骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞中，促成熟分化因子和部分酶類(lèi)，如堿性磷酸酶（ALP）、X型膠原（Col10）和MMP等的表達(dá)，明顯增高；成軟骨因子，如Ⅱ型膠原（Col2）和Aggrecan等的表達(dá)，則明顯減低。在轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄因子Sox9和Runx2在調(diào)控軟骨細(xì)胞增生和分化的方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。Sox9是軟骨細(xì)胞增生和成軟骨因子，如Col2、Aggrecan等合成的重要調(diào)節(jié)因子；Runx2則是軟骨細(xì)胞終末期、病理肥大分化的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，在骨關(guān)節(jié)炎的病理生理過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用［10－12］。

我們的研究結(jié)果顯示，PTH明顯增強(qiáng)Alcian藍(lán)染色的強(qiáng)度，降低ALP染色的強(qiáng)度，表明PTH一方面增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞中軟骨基質(zhì)－蛋白多糖的合成，另一方面則起到抑制堿性磷酸酶合成的作用，而后者是軟骨細(xì)胞終末期分化的重要標(biāo)志性蛋白。另外，RT－PCR和 Westernblot結(jié)果顯示，無(wú)論在m RNA水平，或是蛋白水平，PTH均顯著提高成軟骨因子Sox9和Aggrecan的表達(dá)，降低病理性肥大分化因子Runx2和ALP的表達(dá)。

綜上所述，PTH能夠直接促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成軟骨作用，抑制軟骨細(xì)胞的終末期成熟分化，本研究為PTH抑制骨關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展，在細(xì)胞學(xué)水平提供了一定的依據(jù)。

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圖 版 說(shuō) 明

圖1 新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞ALP染色強(qiáng)度的變化

圖2 新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞成軟骨因子和促病理性肥大因子基因mRNA表達(dá)的變化

圖3 PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

圖4 PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞Alcian藍(lán)染色的影響?！颬＜0.05

圖5 PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞ALP染色的影響?！颬＜0.05

圖6 PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響?！颬＜0.05

圖7 PTH對(duì)新生小鼠胸骨軟骨細(xì)胞細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 ALP staining of mouse sternal chondrocytes

Fig.2 Chondrogenic and hypertrophic marker genes m RNA expression of mouse sternal chondrocytes

Fig.3 Morphology changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment

Fig.4 Alcian blue staining changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment，★denotes statistical significance from controls（P＜0.05）

Fig.5 ALP staining changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment，★denotes statistical significance from controls（P＜0.05）

Fig.6 Marker genes expression of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment，★denotes statistical significance from controls（P＜0.05）

Fig.7 Westernblot changes of mouse sternal chondrocytes by PTH treatment