汪曉慶 張詩武 吳 強 王 弦

（1安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理學(xué)教研室；2安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥230601）

胃惡性腫瘤是消化道最常見的惡性腫瘤之一，而胃腺癌的發(fā)生率占胃惡性腫瘤的95%，是目前世界上第二常見的癌癥［1］。胃腺癌由于早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，臨床上主要的治療方法是手術(shù)切除加化療的綜合治療模式，但患者的5年生存率僅為5%－17%，局部復(fù)發(fā)與術(shù)后轉(zhuǎn)移擴散仍是主要的致死原因。目前關(guān)于其血供途徑的研究主要集中于腫瘤誘導(dǎo)血管生成方面，對于血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimicry，VM）與胃腺癌的關(guān)系研究較少。缺氧誘導(dǎo)因子－1α（Hypoxia inducible factor 1α，HIF－1α）是低氧主要標(biāo)記物，位于與缺氧相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中樞，是缺氧狀態(tài)下腫瘤細胞的主要調(diào)節(jié)因子，在維持腫瘤細胞新生血管形成及促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用［2，3］。有文獻報道，與VM生成相關(guān)的分子或基因可能是HIF－1а下游基因產(chǎn)物的作用靶點。本實驗擬通過CD34和PAS雙重染色技術(shù)觀察胃腺癌中是否存在VM和HIF－1α蛋白的表達，并進一步探討VM的發(fā)生和HIF－1α蛋白表達的關(guān)系及HIF－1α蛋白表達的臨床病理意義。

材料和方法

1.臨床資料

收集安徽省第二人民醫(yī)院2006年1月－2008年4月臨床病例資料完整的、經(jīng)手術(shù)切除的胃腺癌121例。其中中分化腺癌59例，低分化腺癌62例，女27例，男94例，年齡36－79歲，腫瘤直徑＜5cm者50例，≥5cm者71例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者86例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例。低分化胃腺癌中癌細胞呈團塊狀排列的有26例，呈索狀排列的有36例。術(shù)后均經(jīng)2位以上豐富經(jīng)驗的病理醫(yī)師閱HE染色切片證實為胃腺癌，且術(shù)前均未接受化療或放療。

2.主要試劑

鼠抗人單克隆抗體 CD34（MAB－0034）、S－P超敏試劑盒（鼠／兔）（KIT－9710），購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。鼠抗人單克隆抗體HIF－1α克隆號SC－53546（即 用 型 ）、濃 縮 型 DAB 試 劑 盒 （ZLI－9018），購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PAS染色液為安徽醫(yī)科大學(xué)病理教研室配制。

3.CD34和PAS雙重染色方法及VM結(jié)構(gòu)的觀察

首先采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶（SP）法，進行CD34免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色后水流沖洗1min。然后置于0.5%的高碘酸溶液中還原10min，水流沖洗2min后置于Schiff液中，避光環(huán)境下PAS液反應(yīng)15min，自來水沖洗2min，蒸餾水返色10min。蘇木精淺染細胞核，脫水，透明，封片。CD34和PAS雙重染色的切片在顯微鏡下觀察，腫瘤細胞圍成內(nèi)含紅細胞的管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔壁未見CD34陽性、呈梭形的內(nèi)皮細胞環(huán)繞，此種管腔樣結(jié)構(gòu)判定為VM；管壁有CD34陽性細胞和PAS陽性的基底膜樣結(jié)構(gòu)，無論管腔內(nèi)有無紅細胞，均判定為內(nèi)皮依賴性血管。

4.HIF－1α免疫組化染色及結(jié)果判定

將胃腺癌標(biāo)本根據(jù)是否存在VM設(shè)為VM陽性組和VM陰性組，進行HIF－1α免疫組織化學(xué)染色。HIF－1α免疫組織化學(xué)染色方法與CD34免疫組織化學(xué)染色步驟一致，但無PAS復(fù)染步驟，在DAB顯色后即進行蘇木精襯染，脫水透明，封片。結(jié)果判定：HIF－1α蛋白以細胞核內(nèi)有棕黃色細顆粒為陽性，高倍鏡（×400）下每張切片隨機選擇5個視野，計數(shù)200個細胞／視野，共計1000個，無陽性細胞為陰性（－），陽性細胞數(shù)＜10%為（＋），10%－50%為（＋＋），＞50%為（＋＋＋）［4］。

5.統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5軟件進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.胃腺癌標(biāo)本中存在VM

121例胃腺癌患者中有44例存在VM，HE染色鏡下觀察管腔樣結(jié)構(gòu)由腫瘤細胞圍成，無內(nèi)皮細胞襯覆，管腔內(nèi)有紅細胞存在，管腔內(nèi)不見壞死崩解的腫瘤細胞及炎細胞（圖1）。CD34和PAS雙重染色顯示圍成管腔的腫瘤細胞CD34染色均陰性，證實其不是內(nèi)皮細胞（圖2，3），部分病例可見一層斷續(xù)的或連續(xù)的PAS陽性物質(zhì)圍成基底膜樣結(jié)構(gòu)分開腫瘤細胞和紅細胞。

2.胃腺癌組織中HIF－1α的表達情況及其與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

實驗中HIF－1α蛋白在胃腺癌組織中的陽性率為62.81%（76／121）。HIF－1α主要定位于腫瘤細胞核（圖4，5）。腫瘤間質(zhì)也可見HIF－1α陽性細胞。腫瘤壞死區(qū)周圍和腫瘤浸潤邊緣癌細胞HIF－1α表達明顯增多。

胃腺癌組織中HIF－1α的表達與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系（表1）。

3.胃腺癌組織中 HIF－1α的表達與VM 關(guān)系（表2）。

實驗中VM陽性組和VM陰性組HIF－1α蛋白表達陽性率分別為77.27%（34／44）和54.55%（42／77），兩組之間的差異有顯著性（P＜0.05）。

圖1 箭頭所示為胃腺癌中腫瘤細胞圍成的VM.（HE×400）圖2 箭頭所示胃腺癌中腫瘤細胞圍成的VM，圍成管腔的腫瘤細胞CD34染色陰性，可見一層PAS陽性物質(zhì)圍成基底膜樣結(jié)構(gòu)分開瘤細胞和紅細胞.（CD34和PAS雙重染色×400）圖3 箭頭所示CD34陽性的內(nèi)皮依賴性血管，與圖2對比.（CD34和PAS雙重染色×400）圖4 胃腺癌組織中HIF－1α的陽性表達，表現(xiàn)為棕黃色顆粒定位于細胞核.（SP×200）圖5 腺癌組織中HIF－1α的陽性表達，表現(xiàn)為棕黃色顆粒定位于細胞核.（SP×400）圖6 箭頭所示呈片狀分布胃腺癌細胞中的VM.（HE×200）Fig.1 The arrow shows the VM enclosed by cancer cells of gastric carcinoma.（HE×400）Fig.2 The arrow shows the VM enclosed by cancer cells of gastric carcinoma.The CD34 staining of cancer cells that circle as tube cavity indicates negative.A layer of PAS positive substance，surrounding as a pattern of basement membrane，detaches cancer cells and red cells.（CD34 ＆PAS dual staining×400）Fig.3 The arrow shows endothelial dependent vessels of CD34 positive compares with Fig 2.（CD34＆PAS dual staining×400）Fig.4 The positive expression of HIF－1αin gastric carcinoma，indicating yellow－brown particles are positioning in nucleolus.（SP×200）.Fig.5 The positive expression of HIF－1αin gastric carcinoma，indicating yellow－brown particles are positioning in nucleolus.（SP×400）Fig.6 The arrow shows that VM distributes in sheets pattern in gastric adenocarcinoma cells.（HE×200）

表1 HIF－1α表達與胃腺癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Table 1 Relationship between HIF－1αexpression and clinical pathology index of patients suffering from gastric adenocarcinoma

表2 HIF－1α表達與VM的關(guān)系Table 2 Relationship between HIF－1αexpression and VM

討 論

1999年美國Iowa，s大學(xué)的 Maniotis和Folberg等［5，6］在研究葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時發(fā)現(xiàn)一種與經(jīng)典的腫瘤血管生成途徑不同的、不依賴于內(nèi)皮細胞的腫瘤血管生成模式即VM。VM的特點是管腔內(nèi)沒有血管內(nèi)皮細胞的襯覆，內(nèi)皮特異標(biāo)記的免疫組化染色（KDR、CD34、CD31等）呈陰性反應(yīng)，腫瘤細胞模仿血管生成形成細胞條索圍成管道樣結(jié)構(gòu)，血液在這無內(nèi)皮細胞的管道樣結(jié)構(gòu)中流動。由于此種管道樣結(jié)構(gòu)無內(nèi)皮細胞屏障，腫瘤細胞與血液直接接觸，因此具有VM的惡性腫瘤臨床特征為早期即可發(fā)生廣泛的血道轉(zhuǎn)移，腫瘤患者預(yù)后較差。隨著對VM的研究，近年來已在一些高侵襲性惡性腫瘤中如卵巢癌、惡性膠質(zhì)瘤等發(fā)現(xiàn)了VM［7，8］。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)和特殊染色技術(shù)在胃腺癌中證實了VM的存在。首先復(fù)習(xí)HE染色切片發(fā)現(xiàn)在一些中低分化的胃腺癌組織中存在由腫瘤細胞圍成的管道樣結(jié)構(gòu)，管道內(nèi)有紅細胞存在，管壁未見梭形的內(nèi)皮細胞襯覆。CD34和PAS雙重染色后發(fā)現(xiàn)圍成管道的腫瘤細胞CD34染色均陰性，證實其不是內(nèi)皮細胞，腔內(nèi)可見一層PAS陽性物質(zhì)圍成基底膜樣結(jié)構(gòu)分開腫瘤細胞和紅細胞，管腔周圍未見炎細胞浸潤及腫瘤細胞壞死的組織碎片存在，提示該管腔并非腫瘤中央?yún)^(qū)域壞死后形成的空腔，而是一種功能性微循環(huán)。

惡性腫瘤的發(fā)生與細胞的過度增殖有關(guān)，而腫瘤細胞的增殖需要消耗大量的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，雖然惡性腫瘤具有誘導(dǎo)血管生成的能力并形成微血管網(wǎng)，但由于微血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的不足，導(dǎo)致腫瘤缺氧和壞死持續(xù)存在［9－11］，故缺氧是實體腫瘤微環(huán)境普遍存在的一種現(xiàn)象。HIF－1α是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，其過度表達與腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［12］。HIF－1α下游靶基因眾多，包括 VEGF、EPO、Nos、Fit－1、葡萄糖轉(zhuǎn)運因子1、3、糖酵解等，這些基因的表達可導(dǎo)致腫瘤組織氧運輸能力增強、腫瘤細胞有氧代謝減慢而無氧代謝增強以及誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成等，這些都使得腫瘤細胞在缺血缺氧環(huán)境中易于生存并發(fā)生局部浸潤、轉(zhuǎn)移［13－14］。本實驗研究結(jié)果顯示，HIF－1α蛋白表達在胃腺癌組織中的陽性率為62.81%（76／121），且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度密切相關(guān)。提示腫瘤的分化程度越低，腫瘤細胞惡性程度越高，瘤細胞增殖更為迅速、更易缺氧，HIF－1α可能通過轉(zhuǎn)錄激活氧的運輸、糖代謝、腫瘤血管形成等過程中的靶基因，從而影響腫瘤細胞生長、分化、存活，使得腫瘤細胞能適應(yīng)缺氧的微環(huán)境，并不斷增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。筆者在觀察中還發(fā)現(xiàn)VM在腫瘤細胞呈片塊狀分布者中更多見（圖6），可能是呈片塊狀生長的腫瘤細胞更易缺氧，單純依靠內(nèi)皮依賴性血管不足以滿足腫瘤自身生長需要。從而腫瘤通過一系列分子事件啟動促進VM形成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，部分腫瘤細胞模擬血管通道，以保證腫瘤的血液供應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，VM陽性組出現(xiàn)HIF－1α陽性的比例高于VM陰性組，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示與VM生成相關(guān)的分子或基因可能是HIF－1α下游基因產(chǎn)物的作用靶點，HIF－1α是VM形成和腫瘤生長的促進因素。Hentrix等［15］在黑色素瘤裸鼠移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境使惡性黑色素瘤細胞基因型發(fā)生改變，成為胚胎干細胞，并表達某些血管內(nèi)皮細胞基因，使其能夠作為血管內(nèi)皮細胞樣細胞參與VM的形成。還有學(xué)者［16］研究發(fā)現(xiàn)缺氧能誘導(dǎo)卵巢癌細胞SKOV3和ES2細胞高表達HIF－1αm RNA并形成VM，而在常氧條件下不能形成微管道，且表達HIF－1αm RNA極弱。這些結(jié)果均提示了缺氧導(dǎo)致的基因表達改變可能在VM形成過程中起了關(guān)鍵作用。

迄今為止，HIF－1α促進VM 形成的具體機制尚不清楚，這將是筆者今后研究的重點，希望通過筆者的研究可以為抑制腫瘤血液供應(yīng)提供新的思路。

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