邵俊杰，王嘉瑜，滕崢，潘浩，陳洪友，匡小舟，俞雪蓮，朱兆奎，張曦

上海市疾病預防控制中心, 上海 200336

手足口病 (hand, foot and mouth disease, HFMD)是嬰幼兒常見傳染病，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹、潰瘍等為主，個別患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等致命并發(fā)癥[1,2]。手足口病是世界范圍內(nèi)流行的傳染病[3]，近10年來許多國家和地區(qū)均有此病暴發(fā)或流行的報道，已引起普遍關注。手足口病可由多種腸道病毒引起，其中人腸道病毒71型(human enterovirus 71，HEV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16，CA16)為主要病原體。

2008年5月，我國將手足口病納入丙類法定傳染病報告與管理。同年，上海市開展對手足口病常規(guī)監(jiān)測，并于2009年建立各區(qū)(縣)手足口病監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室。 本研究對上海市2009～2011年手足口病的流行病學資料、手足口病監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室數(shù)據(jù)進行分析和總結；對3年內(nèi)分離獲得的部分HEV71毒株的VP1基因序列進行分析，以初步闡明本市手足口病的流行病學及病原學特征，為本市手足口病預防和控制策略的制定提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 流行病學資料

流行病學分析所用數(shù)據(jù)來源于國家疾病監(jiān)測信息報告管理系統(tǒng)。

1.2 標本

收集2009～2011年上海市18個區(qū)(縣)手足口病監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室采集的手足口病病例臨床標本共6 676份(2009年徐匯區(qū)、黃浦區(qū)、長寧區(qū)無送檢標本)，其中2009年799份、2010年2 902份、2011年2 975份。

1.3 核酸提取及檢測

咽拭子或皰疹液標本經(jīng)1 500g離心10 min后，取200 μ l上清液用于核酸提取。使用NucliSens SCNS(梅里埃公司，法國)核酸抽提試劑提取核酸，在待檢標本中加入400 μ l 裂解液，室溫孵育10 min 后加入65 μ l磁珠，上機提取核酸。程序設置按照儀器說明書進行。

使用腸道病毒通用熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測試劑盒、HEV71 熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒和CA16 熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)對所有樣品進行檢測。擴增反應體系和條件按照說明書操作和設置，在Roche LightCycler 480型熒光定量PCR儀上進行。

1.4 病毒分離

將2009～2011年上送的257份HEV71核酸陽性標本接種于正常生長的人橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RD)細胞，鏡下逐日觀察細胞病變情況，對未發(fā)生細胞病變的標本盲傳2代。將發(fā)生細胞病變的培養(yǎng)物凍融3次，離心后取上清液，用HEV71 熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒進行毒株鑒定。

1.5 基因擴增及序列測定

從2009～2011年分離獲得的HEV71陽性毒株中，選取27株(2009年7株、2010年10株、2011年10株)進行VP1編碼區(qū)序列測定，用于HEV71基因特征分析。 引物采用中國疾病預防控制中心設計的VP1基因全長(891 bp)，上游引物：5′ -GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3′ ，下游引物：5′ -AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC-3′ 。 擴增反應采用Invitrogen公司的SuperScriptTMIII One-Step RT-PCR System with Platinum?Taq High Fidelity試劑盒，具體操作參照說明書。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認后進行測序和分析(測序由上海博尚生物技術有限公司完成)。

1.6 序列分析

將本研究中27條HEV71 VP1序列與GenBank下載的不同基因型/亞型HEV71代表株的VP1序列進行同源性及基因進化關系分析，采用Vector NTI生物信息軟件進行序列拼接分析、同源性比對，親緣性關系樹采用MEGA5.05軟件進行構建。

2 結果

2.1 流行病學

2.1.1疫情概況2009～2011年上海市累計報告手足口病102 756例，重癥968例，占病例總數(shù)的0.94%；死亡19例。其中，2010年上海市手足口病報告41 151例，發(fā)病率為214.22/10萬，較2009年上升68.68%；重癥418例，上升113.27%；死亡11例，均為3年中最高值(表1)。

表1 2009～2011年上海市手足口病流行病學概況

Tab.1 Epidemiological characteristic of HFMD cases in Shanghai, 2009-2011

YearCases Severe casesDeathMorbidity(/100 000)Fatality rate(%)200924 2821966128.590.025 201041 15141811214.220.027 201137 3233542162.140.005

2.1.2地區(qū)、時間分布2009～2011年上海市18個區(qū)(縣)均有手足口病病例報告，3年內(nèi)發(fā)病數(shù)居前3位的是浦東新區(qū)20 127例、閔行區(qū)16 012例及寶山區(qū)7 705例。

就發(fā)病時間來看，2009年發(fā)病高峰期為4～7月，此期報告病例數(shù)占全年病例數(shù)的48.97%，11月出現(xiàn)第2個發(fā)病小高峰，病例數(shù)占10.46%。2010年發(fā)病集中在4～6月，其中5月最高，峰值較2009年明顯上升。2011年發(fā)病高峰期較2010年推遲約1個月，主要集中在6～7月，峰值亦明顯降低。

2.1.3人群分布主要發(fā)病年齡為≤5歲的嬰幼兒，其次為6～7歲學生。2009年≤5歲嬰幼兒占發(fā)病人數(shù)的84.2%，2010年和2011年分別占93.1%和91.8%。其中，2009年以2歲組幼兒發(fā)病數(shù)最高，占26.8%；2010和2011年均以1歲組幼兒發(fā)病數(shù)最高，分別占24.8%和24.5%。職業(yè)分布以散居兒童、幼托兒童為主。性別分布以男性為主，男女性別比為1.6∶1。

2.2 病原構成

2.2.1不同地區(qū)的病原構成對2009～2011年上海市18個區(qū)(縣)手足口病監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室6 676例病例標本進行實驗室診斷(2009年徐匯區(qū)、黃浦區(qū)、長寧區(qū)無送檢標本)，4 647例病例標本核酸檢測為腸道病毒陽性，陽性率為69.61%。3年間上海市HEV71和CA16陽性檢出率分別為38.83%和21.26%。除虹口區(qū)、普陀區(qū)、閘北區(qū)以CA16為主外，崇明縣HEV71與CA16構成比相當，其他區(qū)(縣)均以HEV71為主(表2)。

表2 2009～2011年上海市18個區(qū)(縣)手足口病病例病原構成

Tab.2 Pathogen constituent of HFMD cases in Shanghai, 2009-2011

District/CountyCases Positive cases (n,%)Constituent ratio (n,%)HEV71CA16Other HEVBaoshan326235(72.09)141(60.00)70(29.79)24(10.21)Changning686486(70.85)246(50.62)140(28.81)100(20.58)Chongming276183(66.30)71(38.80)70(38.25)42(22.95)Fengxian297214(72.05)103(48.13)59(27.57)52(24.30)Hongkou248152(61.29)55(36.18)68(44.74)29(19.08)Huangpu177123(69.49)61(49.59)24(19.51)38(30.89)Jiading213182(85.45)90(49.45)64(35.16)28(15.38)Jing’an454328(72.25)160(48.78)124(37.80)44(13.41)Jinshan177141(79.66)59(41.84)56(39.72)26(18.44)Luwan296186(62.84)111(59.68)72(38.71)3(1.61)Minhang1 2861 027(79.86)834(81.21)125(12.17)68(6.62)Pudong310205(66.13)106(51.71)86(41.95)13(6.34)Putuo470282(60.00)107(37.94)150(53.19)25(8.87)Qingpu423187(44.21)125(66.84)59(31.55)3(1.60)Songjiang171128(74.85)55(42.97)44(34.38)29(22.66)Xuhui318234(73.58)101(43.16)89(38.03)44(18.80)Yangpu332241(72.59)136(56.43)60(24.90)45(18.67)Zhabei216113(52.32)31(27.43)59(52.21)23(20.35)

2.2.2不同年份的病原構成對不同年份的病原構成情況進行統(tǒng)計，結果表明，2009年手足口病人腸道病毒通用型核酸陽性比例最高，為75.97%，2010和2011年分別為68.71%和68.77%。從HEV71檢出率來看， 2011年HEV71核酸陽性的檢出率為41.34 %，高于2009年的38.67%和2010年的36.29%。CA16核酸陽性的檢出率從2009年的33.54%降至2011年的16.40%，呈逐年下降的趨勢(圖1)。

圖1上海地區(qū)2009～2011年手足口病各病原陽性檢出率

Fig.1 Detection rate of pathogen in Shanghai, 2009-2011

2.3 病毒分離結果

將257例HEV71核酸陽性標本接種細胞傳代后，獲得陽性毒株57株(圖2)，病毒分離陽性率為22.18%。

2.4 HEV71基因特征分析

在2009～2011年分離獲得的HEV71陽性毒株中，選取27株進行HEV71的VP1基因片段擴增(電泳結果見圖3)，大小為927 bp。測序后獲得的VP1基因片段通過Vector NTI軟件對比標準VP1序列剪接后，得到的序列均為891 bp，用于對基因序列分析。

從GenBank上下載A基因型(GenBank號：BrCr/USA/87)、B1基因型(GenBank號：6910/USA/87、Nagoya/JPN/1973)、B2基因型(GenBank號：2952/USA/81、7423/USA/1987)、B3基因型(GenBank號：SK-EV006-SAR/MAS/97、4F/AUS/4/99)、B4基因型(GenBank號：2027/SIN/01、C7-Osaka/JPN/1997)、B5基因型(GenBank號：SB12007-SAR/MAS/03、SB12282-SAR/MAS/03)、C1基因型(GenBank號：0915/USA/87、SB9508-SAR/MAS/03)、C2基因型(GenBank號：8M/AUS/6/99、2641/AUS/95)、C3基因型(GenBank號：03/KOR/00、97-56/HLJ/CHN/97)、C4a基因型(GenBank號：521-09F/SD/CHN/07、521-19T/SD/CHN/07)、C4b基因型(GenBank號：H25/SH/CHN/00、H26/SH/CHN/00)及國內(nèi)部分地區(qū)代表株的VP1序列，作為參考序列進行基因分析。

A: Control RD cells. B: Cells infected with HEV71.

圖2 HEV71引起RD細胞病變

Fig.2 Cytopathic effect of RD cells induced by HEV71

A: From left to right: scdc01/sh/chn/2009, scdc02/sh/chn/2009, scdc03/sh/chn/2009, scdc04/sh/chn/2009, scdc05/sh/chn/2009, scdc06/sh/chn/2009, scdc07/sh/chn/2009, scdc01/sh/chn/2010, scdc02/sh/chn/2010, scdc03/sh/chn/2010, scdc04/sh/chn/2010, scdc05/sh/chn/2010, scdc06/sh/chn/2010, scdc017sh/chn/2010, and marker. B: From left to right: scdc08/sh/chn/2010, scdc09/sh/chn/2010, scdc10/sh/chn/2010, scdc01/sh/chn/2011, scdc02/sh/chn/2011, scdc03/sh/chn/2011, scdc04/sh/chn/2011, scdc05/sh/chn/2011, scdc06/sh/chn/2011, scdc07/sh/chn/2011, scdc08/sh/chn/2011, scdc09/sh/chn/2011, scdc10/sh/chn/2011 and marker.

圖3 VP1基因擴增電泳結果

Fig.3 Electrophoresis results of product amplified by primer VP1

從MEGA5.05生物信息學軟件構建的基因進化樹(圖4)可看出，上海市27株HEV71與C4a 亞型毒株聚為一簇，具有最近的進化親緣性。本研究中27個VP1基因核苷酸同源性為95%～100%，氨基酸同源性為98%～100%。與國內(nèi)其他省市代表株(核苷酸同源性為94%～100%，氨基酸同源性為97%～100%)相比，未發(fā)現(xiàn)特征性差異。

圖4基于VP1核苷酸序列(891 nt)構建的上海HEV71與各基因型/亞型的親緣性關系樹

Fig.4 Phylogenetic tree reconstructed from HEV71 strains from Shanghai and representatives of each genotype/subgenotype, based on nucleotide acid sequences of VP1-coding region (891 nt)

3 討論

手足口病是腸道病毒引起的嬰幼兒常見病，其最主要的病原體是HEV71型和CA16型，少數(shù)病例可由CA4、CA5、CA7、CA9、CA10、CB5、CB6型引起[4-9]。近年來，在亞太地區(qū)不斷有手足口病暴發(fā)流行[10]，且呈上升趨勢。自1969年首次分離到HEV71以來[11]，由于其感染宿主后更易侵犯神經(jīng)系統(tǒng)而導致重癥及死亡病例[12]而越來越受到各方關注。自1981年上海報道手足口病以來[13]，各省市每年均有散發(fā)、暴發(fā)病例。2008年安徽阜陽暴發(fā)的手足口病疫情引起社會各界廣泛關注，衛(wèi)生部將手足口病列入法定丙類傳染病進行監(jiān)管，上海市于2009年建立手足口病防控與監(jiān)測網(wǎng)絡。本研究通過對2009～2011年上海地區(qū)手足口病流行病學及病原學結果進行分析，以了解上海地區(qū)手足口病流行規(guī)律及特點。

與以往研究相似[14]，2009～2011年上海市發(fā)生的手足口病病例男性多于女性，主要以0～5歲嬰幼兒為主，多發(fā)于散居及幼托兒童。因此，該年齡段兒童應列為手足口病防控的主要對象，也是防止手足口病發(fā)展為重癥、死亡病例的重點人群。從區(qū)域分布來看，3年內(nèi)發(fā)病數(shù)居前2位的分別是浦東新區(qū)和閔行區(qū)，這可能與這些區(qū)存在大型兒童醫(yī)院相關。

對3年來上海市18個區(qū)(縣)6 676例手足口病病例進行實驗室診斷，結果顯示2009～2011年造成上海地區(qū)手足口病流行的主要病原仍為HEV71和CA16。值得關注的是，HEV71感染的病例呈上升趨勢，2011年HEV71檢出率高于2009及2010年，這也與HEV71感染存在隔2年出現(xiàn)高發(fā)的特點相符[15]，但其原因有待進一步研究。此外，由于HEV71感染后易侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)并導致重癥及死亡病例，上海地區(qū)手足口病的防控形勢依然嚴峻。CA16感染的病例數(shù)呈逐年下降趨勢，而其他腸道病毒致手足口病病例的構成逐年上升，提示對其他腸道病毒的鑒定與分型有助于手足口病防控工作的開展。對不同區(qū)(縣)HEV71和CA16檢出率的比較發(fā)現(xiàn)，虹口區(qū)、普陀區(qū)、閘北區(qū)以CA16感染為主, 崇明縣兩者比例相當，其余區(qū)(縣)以HEV71感染為主(表2)，提示必須同時對HEV71和CA16采取監(jiān)測和控制措施，才能切實開展好手足口病的防控工作。

此次研究分析的27株HEV71 VP1基因核苷酸序列的同源性為95%～100%，氨基酸同源性為98%～100%，均非常接近國內(nèi)C4a流行株，與其有非常高的同源性，證實上海市2009～2011年流行的HEV71為C4a亞型。本研究與周邊省市[1,16-18]流行株相同，而與國外[2,19-21]研究結果比較，流行株不盡相同，說明國內(nèi)手足口病存在穩(wěn)定優(yōu)勢株。目前國內(nèi)HEV71主要以C4a流行株為主[22-26]。

由此可見，腸道病毒引起的手足口病已成為上海及國內(nèi)其他省市嬰幼兒常見病，發(fā)病率較高，HEV71和CA16仍為主要病原體。對其進行流行病學監(jiān)測和病原體檢測有助于了解本地區(qū)流行株型別及流行株變異對疾病流行的影響，從而對疾病進行更加有效的防控。

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