李蒙，孫桂芹，王蕾，陳力

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題，是導(dǎo)致慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的最主要原因之一，每年有近100萬人死于與HBV感染有關(guān)的各種肝臟疾病[1]。我國是乙型肝炎大國，HBV攜帶者約占全國人口的7%[2]。HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)陽性母親的新生兒[3]和免疫功能低下的人群[4](如肝移植受者)是HBV感染高危人群。HBV疫苗通過主動(dòng)免疫方式對HBV易感人群提供安全、有效的免疫能力。與此互補(bǔ)，肌內(nèi)注射乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)實(shí)現(xiàn)了被動(dòng)免疫，提供了針對HBV接觸后的快速、短期保護(hù)。HBIG在阻斷母嬰傳播(與HBV疫苗聯(lián)用)、防止肝移植患者HBV再感染及突發(fā)情況應(yīng)急處理方面有廣泛應(yīng)用[5-7]。但HBIG作為血液制品，有以下缺點(diǎn)：①接受治療的患者尤其是免疫功能低下者，存在感染潛在未知病原的可能；②除HBV表面抗體(抗-HBs)外，產(chǎn)品中還存在其他抗體和蛋白，反復(fù)使用有造成免疫復(fù)合物疾病的可能；③高效價(jià)抗-HBs的血液供者來源有限。因此，通過體外抗體工程制備針對HBsAg的人源(或人源化)抗HBV單克隆抗體(簡稱單抗)替代HBIG很有必要，是未來的發(fā)展趨勢。

動(dòng)物抗體的人源化和人源抗體是抗HBV單抗藥物研發(fā)的2條主要途徑。人源化抗體是通過鼠源抗體的人源化改造獲得，一般保留鼠源抗體的互補(bǔ)可變區(qū)(complementarity determining region，CDR)及部分骨架區(qū)，產(chǎn)品仍含有5%～10%的鼠源序列。現(xiàn)有多個(gè)人源化抗體已被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市。人源抗體的技術(shù)如噬菌體抗體庫技術(shù)[8]、免疫球蛋白基因克隆技術(shù)[9]、人淋巴細(xì)胞移植小鼠[10]等已成熟，而全球第1個(gè)人源抗體阿達(dá)木單抗(adalimumab)已經(jīng)在2002年上市。盡管如此，抗HBV單抗藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢，主要原因是其功能評價(jià)系統(tǒng)還不成熟，增加了效果研究和質(zhì)量控制的難度，限制了篩選效率，從而降低了研發(fā)進(jìn)度。

藥物臨床前常規(guī)評價(jià)主要包括藥效學(xué)評價(jià)、毒理學(xué)評價(jià)及生產(chǎn)和質(zhì)量控制(圖1)。HBIG臨床前評價(jià)已有評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和流程[11]，且有多個(gè)上市產(chǎn)品。由海外公司研發(fā)上市的產(chǎn)品有HepaGam B(Cangene公司)、HyperHEP B(Talecris Biotherapeutics公司)、Nabi-HB(Nabi公司)和Bayhep B(Bayer公司)等；國產(chǎn)的上市產(chǎn)品有由上海生物制品研究所、華蘭生物工程股份有限公司、成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司等生產(chǎn)的HBIG。目前為止，重組抗HBV單抗藥物還沒有上市產(chǎn)品，其臨床前評價(jià)體系也有待建立。

HBIG是血液制品，有傳染HBV、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人類免疫缺陷病毒1/2型(human immunodeficiency virus types 1 and 2，HIV1/2)、人T細(xì)胞病毒(human T lymphotropic virus，HTLV)、細(xì)小病毒B19等的可能， 所以HBIG的生產(chǎn)工藝強(qiáng)調(diào)病毒滅活過程 (有機(jī)溶劑/表面活性劑法和膜過濾法)。此外，還要對聚合物、細(xì)菌內(nèi)毒素、抗補(bǔ)體活性等指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制。而重組抗HBV抗體由通用工業(yè)生產(chǎn)細(xì)胞株表達(dá)，質(zhì)量控制時(shí)會(huì)關(guān)注DNA殘留、抗生素殘留、蛋白純度等。另外，抗HBV單抗的糖基化檢測也很重要。

紅色框內(nèi)為建議用于評價(jià)抗HBV抗體藥效學(xué)的功能性試驗(yàn)

圖1抗HBV抗體藥物臨床前評價(jià)示意圖

Fig.1 Schematic representation of preclinical evaluation of anti-HBV antibodies

在毒理學(xué)評價(jià)方面，因?yàn)橐延泻芏嘟?jīng)過相似工藝生產(chǎn)并含有相似成分的免疫球蛋白在人體安全應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)，血源性HBIG一般不需進(jìn)行動(dòng)物毒性評價(jià)；而抗HBV單抗需進(jìn)行毒理學(xué)評價(jià)，包括急性毒性、長期毒性、遺傳毒性、生殖毒性及免疫毒性試驗(yàn)等。

藥效學(xué)評價(jià)是整個(gè)臨床前評價(jià)的核心。HBIG是通過陰離子交換層析和超濾方式純化人血漿蛋白成分獲得的，主要成分是IgG，所以認(rèn)為其作用與人循環(huán)系統(tǒng)中的IgG相同，只需對其抗-HBs效價(jià)進(jìn)行評價(jià)(不低于100 IU/ml)?？笻BV單抗在藥效學(xué)評價(jià)中也需評價(jià)其抗-HBs效價(jià)，但僅抗-HBs效價(jià)高是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。本實(shí)驗(yàn)室篩選的高效價(jià)抗HBV單抗中，有幾株在后續(xù)功能性評價(jià)(與HBsAg形成抗原抗體復(fù)合物及血清病毒清除試驗(yàn))中并沒有很好的效果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，相比HBIG，重組抗HBV抗體在臨床前藥效學(xué)評價(jià)中需進(jìn)行更多研究。本文主要介紹抗HBV單抗研究中用到的藥效學(xué)評價(jià)方法。

1 體外功能評價(jià)

1.1 細(xì)胞感染評價(jià)體系

雖然HBV的研究已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史，但迄今尚未建立有效的細(xì)胞感染模型。目前常見的研究體系如下所列。

1.1.1樹鼩細(xì)胞感染模型該模型在1996年由Walter等[12]首次報(bào)道。利用該系統(tǒng)，德國的Glebe等[13]發(fā)現(xiàn)HBV的Pre S1蛋白在感染樹鼩肝細(xì)胞中起重要作用。最近，李文輝等[14]借鑒Walter等報(bào)道的樹鼩肝細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，提供了鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為HBV功能性受體的相關(guān)證據(jù)。但是，影響樹鼩原代肝細(xì)胞HBV感染模型感染成功率的因素較多，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性需提高，目前還不宜用于抗HBV單抗的功能性評價(jià)。

1.1.2人原代肝細(xì)胞感染模型研究表明，HBV可高效感染人肝細(xì)胞[15,16]。但由于人肝細(xì)胞來源有限，批次間差異性大，評價(jià)HBV單抗極少用到該細(xì)胞模型。

1.1.3 HepG2細(xì)胞感染模型HepG2細(xì)胞是一種人肝腫瘤細(xì)胞，無法自然感染HBV。但通過人工轉(zhuǎn)染病毒基因，可實(shí)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。如HepG2.2.15細(xì)胞株，即用2個(gè)頭尾相連的HBV DNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞HepG2而成。作為HBV復(fù)制細(xì)胞模型，HepG2.2.15細(xì)胞株及其他轉(zhuǎn)染特定目的HBV DNA的HepG2細(xì)胞株廣泛應(yīng)用于拉米夫定[17]、替諾福韋[18]、阿德福韋酯[19]等核苷類似物和中草藥[20]的抗病毒評價(jià)。Paran等[21]用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理HepG2細(xì)胞，可使HepG2細(xì)胞感染HBV；但Gripon等[22]研究不能重復(fù)以上現(xiàn)象，說明HepG2細(xì)胞感染體系并不穩(wěn)定，其用于藥物抗感染功能評價(jià)也未見報(bào)道。另外，也有研究報(bào)道HBV可感染HepRG細(xì)胞[22]，但也存在感染效率低和穩(wěn)定性差的問題。

1.2 其他體外評價(jià)體系

由于缺乏細(xì)胞感染評價(jià)體系，抗HBV單抗藥物的研發(fā)明顯落后于抗腫瘤單抗及抗其他病毒單抗。為改變這一現(xiàn)況，提高抗HBV單抗藥物研發(fā)的成藥率，人們開展了大量研究，建立了一些有效的功能性評價(jià)方法。這些方法的建立和組合，為抗HBV單抗藥物的功能性研究提供了新的思路和方法，提高了候選單抗的成藥性。

1.2.1常規(guī)抗體與HBsAg結(jié)合試驗(yàn)HBsAg由226個(gè)氨基酸組成，其中的a決定簇為中和表位。雖然HBsAg的三維結(jié)構(gòu)仍不清楚，但結(jié)構(gòu)功能性分析研究表明a決定簇位于親水區(qū)(氨基酸殘基99～169位)。根據(jù)122位上的氨基酸是賴氨酸還是精氨酸，HBsAg分為d和y決定簇；根據(jù)160位上的氨基酸是賴氨酸還是精氨酸，又分為w和r決定簇。因此，HBsAg有4種主要血清型：adw、adr、ayw、ayr。這4種血清型有不同的地理分布[23]。一種單抗可結(jié)合的血清型越多，適用的地域就越廣。

常規(guī)抗原抗體結(jié)合試驗(yàn)是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的原理和方法實(shí)現(xiàn)的，目前實(shí)驗(yàn)室常用的有抗原夾心法和抗體夾心法?？乖瓓A心法是利用未標(biāo)記的抗原鋪板，在捕獲待測抗體后，利用標(biāo)記的抗原檢測捕獲的抗體?？贵w夾心法的過程與此類似。上述方法在臨床和基礎(chǔ)研究中廣為應(yīng)用。

1.2.2抗HBV單抗親和力測定抗HBV單抗親和力(結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù))的測定與其他單抗類似，最常使用的是生物分子相互作用分析儀(Biomolecular Interaction Analysis, BIAcore)。現(xiàn)已報(bào)道的抗HBV單抗與HBsAg蛋白的親和力為3.3×107L/mol(HB48-33)～2×109L/mol(mAb 19.79.5)[24-26]。

1.2.3微粒沉降法將候選單抗與蛋白A 瓊脂糖或磁珠偶聯(lián)后，加入血清，結(jié)合血清中的HBV顆粒，通過離心獲得抗體微粒/抗原沉淀。沉淀中的抗原越多，表明待評價(jià)單抗與HBV結(jié)合越好，反映抗HBV單抗?jié)撛诘闹泻湍芰?。此?shí)驗(yàn)中蛋白A 瓊脂糖或磁珠為單抗與HBV顆粒的結(jié)合提供了人為反應(yīng)界面，在報(bào)道的多株抗-HBs評價(jià)中都用到這種方法[24，25]。

1.2.4沉降性病毒/抗體復(fù)合物檢測在微粒沉降法中，雖然黏附在微粒上的抗體可用于測定抗體在血清中結(jié)合抗原的能力，但由于待測抗體與被抗體吸附的抗原是通過微粒沉降，評價(jià)條件并不能完全模擬人體血液中游離抗體與病毒結(jié)合的狀態(tài)。針對這一現(xiàn)象，陳力等利用抗體與病毒在血清中結(jié)合后形成沉降性病毒/抗體復(fù)合物的特點(diǎn)，建立了檢測沉降性病毒/抗體復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)條件和方法[27]，并應(yīng)用于抗HBV單抗藥物的篩選。該方法成功模擬了中和抗體在體內(nèi)清除病毒的過程和能力，且排除了微粒界面、平板界面及蛋白偶聯(lián)反應(yīng)引入的干擾，為抗HBV單抗藥物的評價(jià)提供了一個(gè)簡單、實(shí)用的選擇。

2 體內(nèi)功能評價(jià)

鴨模型和土撥鼠模型中的病原體均不同于自然宿主為人的HBV，所以在評價(jià)重組抗HBV抗體方面作用有限。猩猩可感染HBV，但考慮到動(dòng)物來源、價(jià)格及倫理，很難廣泛應(yīng)用，一般在其他小動(dòng)物評價(jià)有效的情況下才最后考慮。下面介紹目前幾種用于重組抗HBV抗體評價(jià)的動(dòng)物模型。

2.1 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型

利用各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將不同長度HBV基因?qū)胄∈髥渭?xì)胞受精卵核內(nèi)，再植入假孕母體，使之正常發(fā)育為可復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)HBV基因的小鼠，并遺傳給后代，此即HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠模型分為HBV部分片段、全長或超長序列等幾種模型。僅表達(dá)HBsAg而不存在HBV病毒顆粒的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型有多種。雖然多數(shù)模型中不存在HBV病毒顆粒，但表達(dá)的HBsAg以亞病毒顆粒形式存在，適用于評價(jià)作用靶點(diǎn)為HBsAg的抗HBV抗體。

2.1.1肝特異性表達(dá)模型Chisari等[28]構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中插入的是PreS1、PreS2、S和X基因。該模型利用鼠白蛋白啟動(dòng)子，保證了HBsAg在小鼠肝臟表達(dá)的特異性，較好模擬了HBsAg在人肝的特異性表達(dá)情況。在這一轉(zhuǎn)基因小鼠模型中HBsAg的表達(dá)量不高，但較穩(wěn)定，也能模擬母嬰傳播時(shí)嬰兒體內(nèi)低HBsAg水平。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用該小鼠模型，已成功評價(jià)了多株人源抗HBV單抗[29]。

2.1.2 HBV高表達(dá)模型上海南方模式生物研究中心與復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作構(gòu)建[30]的轉(zhuǎn)基因小鼠模型插入的是線性HBV基因全長，使用的是病毒自身的啟動(dòng)子，HBsAg表達(dá)量是Chisari等建立模型的200倍左右，能較好模擬肝移植患者體內(nèi)的HBsAg水平。該模型不具有肝表達(dá)特異性，其HBsAg高表達(dá)性與Chisari模型的肝特異性各有優(yōu)勢。

2.2 水動(dòng)力法注射HBV DNA建立的急性HBV感染小鼠模型

急性HBV感染小鼠模型是利用水動(dòng)力法對6～9周正常小鼠尾靜脈注射含有目的片段HBV1.3質(zhì)粒而建立的。注射后的第1天，血清中HBsAg和HBV e 抗原(HBV e antigen，HBeAg)均達(dá)到高峰，第7天消失。最早出現(xiàn)的抗體是HBV核心抗體(抗-HBc)，然后是HBV e抗體(抗-HBe)，最后才是抗-HBs，這與人感染HBV后急性清除時(shí)血清標(biāo)記的變化順序一致。病毒顆粒在第1天檢測不到；第6天達(dá)到高峰，峰值可達(dá)106數(shù)量級；第20天消失。第7天出現(xiàn)HBV特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反應(yīng)[31]。

該模型已用于抗HBV單抗中和小鼠體內(nèi)HBsAg的研究。韓國綠十字公司的研究顯示，該公司研發(fā)的3株人源抗體HB48-33、HB48-35、HB48-59在給藥24 h和48 h后均能有效將HBsAg降至檢出限以下[31]。但是，由于該模型實(shí)驗(yàn)操作過程中可變因素較多，小鼠個(gè)體間差異大，結(jié)果難以重復(fù)。

值得一提的是，通過水動(dòng)力法注射HBV DNA獲得的病毒不具有再感染小鼠肝細(xì)胞的能力。因此，利用該模型只能觀察抗HBV單抗對已合成病毒的影響，而不能觀察抗體是否具有阻斷病毒感染的能力。

2.3 HBV感染人肝嵌合小鼠模型

可感染人HBV的人肝嵌合小鼠模型是通過某種方式影響小鼠正常肝臟組織生長，再移植人正常肝細(xì)胞給小鼠，使人肝細(xì)胞在小鼠體內(nèi)繁殖，形成人肝組織/小鼠肝組織的嵌合小鼠。HBV可感染小鼠體內(nèi)人肝組織，對這一感染過程的干預(yù)可用于抗HBV感染藥物的研究?，F(xiàn)有人肝嵌合小鼠模型包括Trimera小鼠模型[32]、NOD/SCID小鼠模型[33]、uPA/SCID小鼠模型[34]及Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠模型[35]。這些人肝嵌合小鼠模型各有特色。Trimera小鼠模型已用于抗HBV單抗17.1.41和19.79.5的研究[24]。但人肝嵌合小鼠模型都不成熟，用于抗HBV感染藥物的評價(jià)還有待技術(shù)和條件的改進(jìn)。

2.4 HBV感染靈長類動(dòng)物模型

非人類的靈長類動(dòng)物(黑猩猩、長臂猿等)可感染HBV，且感染的HBV基因型與感染人類的基本一致[36]。黑猩猩是最早發(fā)現(xiàn)能感染人HBV的動(dòng)物品系，感染HBV后的血清學(xué)和肝臟病理改變與人接近。但黑猩猩的使用受來源、價(jià)格和倫理等因素的限制。

Kim等[37]利用正常的黑猩猩評價(jià)人源化單抗HuS10中和HBV及預(yù)防感染的能力。實(shí)驗(yàn)組黑猩猩靜脈注射5 mg/kg HuS10，3 d后接種人血清HBV；對照黑猩猩注射磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)3 d后接種人血清HBV。結(jié)果表明HuS10可推遲HBV感染。Allen等[17]利用已建立HBV慢性感染的黑猩猩模型對抗HBV單抗(17.1.41和19.79.5)評價(jià)時(shí)發(fā)現(xiàn)，合適劑量的2種抗HBV單抗聯(lián)合使用可有效降低HBsAg水平，持續(xù)數(shù)天。

3 抗原表位定位

確定單抗的抗原表位有利于單抗的專利保護(hù)及確定應(yīng)用范圍?？贵w識別的抗原表位稱B細(xì)胞表位，分為構(gòu)象表位和線性表位2種。線性表位由連續(xù)的氨基酸序列組成。識別線性表位的待評價(jià)單抗能識別變性蛋白上的線性表位。構(gòu)象表位由空間結(jié)構(gòu)相互鄰近的氨基酸或多糖構(gòu)成，一般存在于天然抗原分子表面，不經(jīng)加工處理即可直接被單抗識別，蛋白質(zhì)變性后構(gòu)象表位消失。

利用蛋白免疫印跡法的變性膠和非變性膠可快速區(qū)分待評價(jià)單抗的抗原表位是線性還是構(gòu)象。在變性膠的狀況下，抗原分子空間結(jié)構(gòu)改變。如果此時(shí)單抗仍能識別抗原，說明是線性表位；如果此時(shí)不能識別抗原分子，而在非變性膠的狀況下又能識別抗原分子，則說明可能是構(gòu)象表位。這種方法在單克隆抗-HBs的抗原表位定位中較常用[24,25]。

鑒定線性表位的方法有多種。肽掃描是一種常用方法，主要是合成與靶蛋白氨基酸序列相似的短重疊肽，然后用酶聯(lián)免疫分析其與待評價(jià)單抗的作用及其與待評價(jià)單抗結(jié)合的程度來預(yù)測線性表位。其他方法如氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)、噬菌體展示肽技術(shù)等都可用來鑒定線性表位。然而，大多數(shù)抗原表位是構(gòu)象表位。Delaney等[18]對單克隆抗-HBs-HB-C7A使用肽掃描技術(shù)，沒有找到HB-C7A與不同肽段結(jié)合的峰值，不能篩選出明確的抗原表位。

抗原抗體復(fù)合物的X線晶體學(xué)分析確定抗原表位是抗原表位鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，大多數(shù)抗體的抗原表位是構(gòu)象表位，由晶體學(xué)提供的信息包括抗原抗體復(fù)合物分子之間的作用和氨基酸之間的相互作用。但該方法復(fù)雜、成本高，且要求有適宜的晶體，所以在單克隆抗-HBs的研究中未見應(yīng)用。

現(xiàn)報(bào)道的大部分單克隆抗-HBs是構(gòu)象表位，空間結(jié)構(gòu)還不確定；此外，HBsAg有脂成分存在，而這部分脂成分對抗原表位的形成是否有影響還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

單抗技術(shù)的成熟和發(fā)展為一些臨床疾病的治療打開了新的思路，已廣泛應(yīng)用于治療自身免疫性疾病、腫瘤、心血管疾病、器官移植等。這些已有的經(jīng)驗(yàn)是抗HBV單抗藥物研發(fā)的重要基礎(chǔ)。目前，HBV單抗的研發(fā)受受體不明、細(xì)胞感染模型缺失及動(dòng)物感染模型成本高等因素制約，進(jìn)展相對落后。因此，建立簡單、穩(wěn)定、有效的HBV單抗評價(jià)體系非常重要。

[1] de Franchis R, Hadengue A, Lau G, Lavanchy D, Lok A, McIntyre N, Mele A, Paumgartner G, Pietrangelo A, Rodés J, Rosenberg W, Valla D, EASL Jury. EASL International Consensus Conference on Hepatitis B. 13-14 September, 2002 Geneva, Switzerland. Consensus statement (long version)[J]. J Hepatol, 2003, 39(Suppl 1): S3-S25.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì), 中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì). 慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]. 中華肝臟病雜志, 2011, 19(1): 13-24.

[3] Marion SA, Tomm Pastore M, Pi DW, Mathias RG. Long-term follow-up of hepatitis B vaccine in infants of carrier mothers [J]. Am J Epidemiol, 1994, 140(8): 734-746.

[4] O'Grady JG, Smith HM, Davies SE, Daniels HM, Donaldson PT, Tan KC, Portmann B, Alexander GJ, Williams R. Hepatitis B virus reinfection after orthotopic liver transplantation. Serological and clinical implications [J]. J Hepatol, 1992, 14(1): 104-111.

[5] Wong VC, Ip HM, Reesink HW, Lelie PN, Reerink-Brongers EE, Yeung CY, Ma HK. Prevention of the HBsAg carrier state in newborn infants of mothers who are chronic carriers of HBsAg and HBeAg by administration of hepatitis-B vaccine and hepatitis-B immunoglobulin. Double-blind randomised placebo-controlled study [J]. Lancet, 1984, 1(8383): 921-926.

[6] Shouval D, Samuel D. Hepatitis B immune globulin to prevent hepatitis B virus graft reinfection following liver transplantation: a concise review [J]. Hepatology, 2000, 32(6): 1189-1195.

[7] Dehghani SM, Taghavi SA, Geramizadeh B, Nikeghbalian S, Derakhshan N, Malekpour A, Malek-Hosseini SA. Hepatitis B recurrence after liver transplantation: a single center experiences and review the literature [J]. Hepat Mon, 2013, 13(1): e6609.

[8] Kim SJ, Jang MH, Stapleton JT, Yoon SO, Kim KS, Jeon ES, Hong HJ. Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display [J]. Virology, 2004, 318(2): 598-607.

[9] Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus [J]. Nat Med, 2004, 10(8): 871-875.

[10] Eren R, Lubin I, Terkieltaub D, Ben-Moshe O, Zauberman A, Uhlmann R, Tzahor T, Moss S, Ilan E, Shouval D, Galun E, Daudi N, Marcus H, Reisner Y, Dagan S. Human monoclonal antibodies specific to hepatitis B virus generated in a human/mouse radiation chimera: the Trimera system [J]. Immunology, 1998, 93(2): 154-161.

[11] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典2010年版三部[M]. 北京: 中藥醫(yī)藥科技出版社, 2010, 220-221.

[12] Walter E, Keist R, Nieder?st B, Pult I, Blum HE. Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo [J]. Hepatology, 1996, 24(1): 1-5.

[13] Glebe D, Aliakbari M, Krass P, Knoop EV, Valerius KP, Gerlich WH. Pre-s1 antigen-dependent infection of Tupaia hepatocyte cultures with human hepatitis B virus [J]. J Virol, 2003, 77(17): 9511-9521.

[14] Yan H, Zhong G, Xu G, He W, Jing Z, Gao Z, Huang Y, Qi Y, Peng B, Wang H, Fu L, Song M, Chen P, Gao W, Ren B, Sun Y, Cai T, Feng X, Sui J, Li W. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus [J]. Elife, 2012, 1: e00049.

[15] Gripon P, Diot C, Thézé N, Fourel I, Loreal O, Brechot C, Guguen-Guillouzo C. Hepatitis B virus infection of adult human hepatocytes cultured in the presence of dimethyl sulfoxide [J]. J Virol, 1988, 62(11): 4136-4143.

[16] Schulze-Bergkamen H, Untergasser A, Dax A, Vogel H, Büchler P, Klar E, Lehnert T, Friess H, Büchler MW, Kirschfink M, Stremmel W, Krammer PH, Müller M, Protzer U. Primary human hepatocytes—a valuable tool for investigation of apoptosis and hepatitis B virus infection [J]. J Hepatol, 2003, 38(6): 736-744.

[17] Allen MI, Deslauriers M, Andrews CW, Tipples GA, Walters KA, Tyrrell DL, Brown N, Condreay LD. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Lamivudine Clinical Investigation Group [J]. Hepatology, 1998, 27(6): 1670-1677.

[18] Delaney WE 4th, Ray AS, Yang H, Qi X, Xiong S, Zhu Y, Miller MD. Intracellular metabolism and in vitro activity of tenofovir against hepatitis B virus [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50(7): 2471-2477.

[19] Schildgen O, Sirma H, Funk A, Olotu C, Wend UC, Hartmann H, Helm M, Rockstroh JK, Willems WR, Will H, Gerlich WH. Variant of hepatitis B virus with primary resistance to adefovir [J]. N Engl J Med, 2006, 354(17): 1807-1812.

[20] Chen Y, Zhu J. Anti-HBV effect of individual traditional Chinese herbal medicine in vitro and in vivo: an analytic review [J]. J Viral Hepat, 2013, 20(7): 445-452.

[21] Paran N, Geiger B, Shaul Y. HBV infection of cell culture: evidence for multivalent and cooperative attachment [J]. EMBO J, 2001, 20(16): 4443-4453.

[22] Gripon P, Rumin S, Urban S, Le Seyec J, Glaise D, Cannie I, Guyomard C, Lucas J, Trepo C, Guguen-Guillouzo C. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(24): 15655-15660.

[23] Norder H, Couroucé AM, Coursaget P, Echevarria JM, Lee SD, Mushahwar IK, Robertson BH, Locarnini S, Magnius LO. Genetic diversity of hepatitis B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HBsAg subtypes [J]. Intervirology, 2004, 47(6): 289-309.

[24] Eren R, Ilan E, Nussbaum O, Lubin I, Terkieltaub D, Arazi Y, Ben-Moshe O, Kitchinzky A, Berr S, Gopher J, Zauberman A, Galun E, Shouval D, Daudi N, Eid A, Jurim O, Magnius LO, Hammas B, Reisner Y, Dagan S. Preclinical evaluation of two human anti-hepatitis B virus (HBV) monoclonal antibodies in the HBV-trimera mouse model and in HBV chronic carrier chimpanzees [J]. Hepatology, 2000, 32(3): 588-596.

[25] Shin YW, Ryoo KH, Hong KW, Chang KH, Choi JS, So M, Kim PK, Park JY, Bong KT, Kim SH. Human monoclonal antibody against hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) [J]. Antiviral Res, 2007, 75(2): 113-120.

[26] Kim S, Chang K, Hong K. Human antibodies specifically binding to the hepatitis B virus surface antigen [P]. US patent: 20120264921, 2012-10-18.

[27] 陳力, 聞?dòng)衩? 王蕾,謝幼華,梁米芳. 一種檢測和評價(jià)抗病毒感染活性的方法[P]. 中國專利: 201201853290, 2012-06-06.

[28] Chisari FV, Pinkert CA, Milich DR, Filippi P, McLachlan A, Palmiter RD, Brinster RL. A transgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state [J]. Science, 1985, 230(4730): 1157-1160.

[29] 陳力, 聞?dòng)衩? 李蒙. 一種檢測和評價(jià)分子和藥物生物學(xué)功能的方法和用途[P]. 中國專利: 2013100513614, 2013-02-08.

[30] Ren J, Wang L, Chen Z, Ma ZM, Zhu HG, Yang DL, Li XY, Wang BI, Fei J, Wang ZG, Wen YM. Gene expression profile of transgenic mouse kidney reveals pathogenesis of hepatitis B virus associated nephropathy [J]. J Med Virol, 2006, 78(5): 551-560.

[31] Yang PL, Althage A, Chung J, Chisari FV. Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(21): 13825-13830.

[32] Ilan E, Burakova T, Dagan S, Nussbaum O, Lubin I, Eren R, Ben-Moshe O, Arazi J, Berr S, Neville L, Yuen L, Mansour TS, Gillard J, Eid A, Jurim O, Shouval D, Reisner Y, Galun E. The hepatitis B virus-trimera mouse: a model for human HBV infection and evaluation of anti-HBV therapeutic agents [J]. Hepatology, 1999, 29(2): 553-562.

[33] Ohashi K, Marion PL, Nakai H, Meuse L, Cullen JM, Bordier BB, Schwall R, Greenberg HB, Glenn JS, Kay MA. Sustained survival of human hepatocytes in mice: A model for in vivo infection with human hepatitis B and hepatitis delta viruses [J]. Nat Med, 2000, 6(3) :327-331.

[34] Tsuge M, Hiraga N, Takaishi H, Noguchi C, Oga H, Imamura M, Takahashi S, Iwao E, Fujimoto Y, Ochi H, Chayama K, Tateno C, Yoshizato K. Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engineered hepatitis B virus [J]. Hepatology, 2005, 42(5): 1046-1054.

[35] Bissig KD, Wieland SF, Tran P, Isogawa M, Le TT, Chisari FV, Verma IM. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment [J]. J Clin Invest, 2010, 120(3): 924-930.

[36] Kamili S, Sozzi V, Thompson G, Campbell K, Walker CM, Locarnini S, Krawczynski K. Efficacy of hepatitis B vaccine against antiviral drug-resistant hepatitis B virus mutants in the chimpanzee model [J]. Hepatology, 2009, 49(5): 1483-1491.

[37] Kim SH, Kim SH, Oh HK, Ryu CJ, Park SY, Hong HJ. In vivo hepatitis B virus-neutralizing activity of an anti-HBsAg humanized antibody in chimpanzees [J]. Exp Mol Med, 2008, 40(1): 145-149.