王 震 陳 浩 邢蓓蓓 黃大可李 響 汪 淵 朱華慶 賈雪梅＊

（安徽醫(yī)科大學1第一臨床學院；2形態(tài)學中心實驗室；3生化教研室，安徽 合肥230032）

肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是平滑肌細胞收縮的必要激酶，當平滑肌細胞由于外界刺激使細胞內(nèi)Ca2＋濃度升高時，Ca2＋首先結(jié)合于鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM），Ca2＋與CaM的復合物進一步結(jié)合并激活胞內(nèi)的MLCK，活化的MLCK可使橫橋中一對分子量為20Kd的肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）磷酸化，可使橫橋ATP酶活性提高，并引發(fā)粗、細肌絲間的滑行和肌肉收縮［1］。MLCK的磷酸化調(diào)節(jié)在不同的細胞中有不同的作用，MLCK對于真核細胞的肌球蛋白磷酸化作用并不是十分清楚，有研究表明其與細胞分裂、受體帶帽以及血小板或內(nèi)皮細胞活動有關(guān)［2］。此外，在部分非肌細胞如胰腺導管上皮細胞、淚腺腺泡上皮細胞以及嗜鉻細胞的分泌過程中，MLCK可能發(fā)揮重要作用［3－5］。本實驗通過免疫組化技術(shù)檢測正常大鼠胃黏膜MLCK的表達和分布特點，初步探討MLCK在胃黏膜非肌細胞內(nèi)的表達及意義。

材料和方法

1．試劑

MLCK的抗體和SABC免疫組化試劑盒均購自SIGMA公司和北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2．標本制備

取重量為300－400克SD雄性大鼠11只（安徽醫(yī)科大學動物中心提供）。

將大鼠放血處死，取胃組織固定于10%甲醛溶液，石蠟包埋，切片厚4μm，進行免疫組織組化染色。

3．免疫組化染色

采用SP法進行免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O237℃孵育10min；抗原修復：置0．01 mol／L枸櫞酸緩沖液（pH 6．0）微波煮沸，自然冷卻；正常血清封閉10min；滴加一抗（兔抗鼠 MLCK單克隆抗體），4℃ 冰箱孵育過夜；滴加生物素標記二抗，37℃孵育30min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，以上各步驟間均以PBS沖洗5min×3；DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明和封片。

4．對照實驗

用PBS替代第一抗體作陰性對照。

5．免疫組化判斷標準

不著色為陰性 （－）；淺棕色為弱陽性（＋）；中等棕色為中等陽性 （＋＋）；深棕色為較強陽性（＋＋＋）；棕褐為強陽性（＋＋＋＋）。

結(jié) 果

陰性對照結(jié)果為陰性反應（－）（圖1）。

光鏡下可見大鼠胃壁的黏膜肌層、肌層和黏膜下層處的血管壁平滑肌均呈MLCK免疫組化強陽性反應（＋＋＋－＋＋＋＋），為棕黃或棕褐色。

在黏膜層胃底腺中可見有MLCK免疫反應陽性細胞，為強陽性反應（＋＋＋－＋＋＋＋）。高倍鏡下，MLCK分布不盡相同，有的腺細胞整個胞漿呈MLCK免疫反應強陽性（＋＋＋－＋＋＋＋），也有部分腺細胞的頂端呈MLCK免疫反應強陽性（＋＋＋－＋＋＋＋）。經(jīng)HE染色鄰片比較初步判定，免疫反應陽性細胞主要為壁細胞和主細胞（圖2－3）。細胞核為陰性反應（－）。

圖1 陰性對照實驗大鼠胃MLCK為陰性反應．（SP法×400）圖2 MLCK表達于大鼠胃黏膜部分壁細胞胞漿內(nèi)．（SP法×400）圖3 MLCK表達于大鼠胃黏膜部分主細胞胞漿頂部．（SP法×400）Fig．1The experssion of MLCK in the stomach of rats shows almost negative．（SP×400）Fig．2MLCK is expressed in the entire cytoplasm in part of the parietal cells．（SP×400）Fig．3MLCK is expressed at the top of cytoplasm in part of the chief cells．（SP×400）

討 論

以往研究表明，MLCK是平滑肌收縮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，當Ca2＋與CaM結(jié)合后激活MLCK，使肌球蛋白20Kd輕鏈磷酸化，從而激活肌球蛋白頭部ATP酶活性，導致 Mg2＋－ATP分解，水解后的ATP產(chǎn)生能量使肌球蛋白與肌動蛋白相互作用，引起肌肉收縮，即經(jīng)典的“磷酸化”途徑［1］。本實驗結(jié)果表明MLCK大量表達于血管壁上、胃壁的肌層和黏膜肌層中平滑肌細胞內(nèi)，提示平滑肌內(nèi)MLCK是參與其收縮活動的調(diào)節(jié)蛋白之一。

本實驗發(fā)現(xiàn)，MLCK除表達于平滑肌外，胃組織中一些非肌細胞中也有MLCK表達，主要分布于胃底腺壁細胞和主細胞胞質(zhì)內(nèi)，MLCK表達的部位不盡相同，或表達于部分主細胞頂部，或表達于部分壁細胞整個胞漿。主細胞頂端有MLCK表達，這正是酶原顆粒所在的位置，可能與主細胞分泌過程有關(guān)。正常狀態(tài)下，主細胞的分泌功能受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，乙酰膽堿、CCK通過激活主細胞膜上的特異性受體，提高細胞內(nèi)鈣離子濃度從而促進胃蛋白酶原的分泌［6］，其中鈣離子濃度的升高為MLCK發(fā)揮作用提供了基礎(chǔ)。并且已有實驗通過使用CaM拮抗劑氯丙嗪和W－7證明CaM對于胃蛋白酶原的分泌起到重要的作用［7］。Okayama N等用MLCK的特異性阻斷劑ML－9阻斷人工培育的主細胞內(nèi)MLCK的功能活動，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由卡巴膽堿誘導的主細胞分泌活動被明顯抑制［8］，在很多非肌細胞中，纖維狀肌動蛋白（fibros actin，F(xiàn)－actin）和肌球蛋白都參與調(diào)節(jié)復雜的囊泡轉(zhuǎn)運［9］。另外，其它一些具有分泌功能的細胞如PC12細胞和腎臟髓質(zhì)集合管上皮細胞，前者在分泌過程中，通過肌球蛋白作用于胞膜下的肌動蛋白控制融合孔隙，控制了每個囊泡中激素的釋放量［10］；對于后者，在由血管加壓素所誘導的水通道蛋白2（aquaporin－2，AQP2）轉(zhuǎn)運至管腔膜的過程中，所觸發(fā)的Ca2＋參與信號通路里，CaM和MLCK很可能是下游效應分子，對AQP2的轉(zhuǎn)運發(fā)揮重要作用［11］。由此推測MLCK在主細胞分泌過程中發(fā)揮極為重要的作用，并且很可能通過肌動蛋白和肌球蛋白機制調(diào)控主細胞酶原顆粒的分泌活動，因為在一些分泌細胞中，利用肌動蛋白抑制劑和MLCK抑制劑，可以導致分泌囊泡與胞膜的融合孔隙關(guān)閉［12］；其它類似的生理過程表明，MLCK可能參與了胰腺導管上皮細胞的分泌、淚腺腺泡上皮細胞的出胞以及嗜鉻細胞的胞吐等過程［3－5］。因而MLCK參與胃蛋白酶原的分泌過程的可能機制是：位于細胞頂部的F－actin起著阻礙分泌囊泡與細胞膜的接觸或融合的作用，當主細胞分泌胃蛋白酶原時，細胞內(nèi)濃度升高的Ca2＋與CaM結(jié)合后激活MLCK，MLCK的激酶活性使肌球蛋白磷酸化，肌球蛋白和肌動蛋白相互作用，從而使F－actin解聚，囊泡即可與細胞膜接觸融合，而完成分泌過程［13］。

胃底腺壁細胞有兩種特征性的質(zhì)膜系統(tǒng)，一種是分泌小管，由壁細胞游離面質(zhì)膜向胞內(nèi)凹陷所形成的特殊網(wǎng)管結(jié)構(gòu)，其內(nèi)襯以大量微絨毛，微絨毛核心正是由肌動蛋白構(gòu)成的微絲；另一種是微管泡系統(tǒng)，是質(zhì)膜的一種儲存形式。在壁細胞泌酸過程中，微絨毛內(nèi)的肌動蛋白絲介導分泌小管和微管泡系統(tǒng)的融合，質(zhì)子泵被轉(zhuǎn)移至膜頂端，H＋泵出和K＋交換，從而達到分泌鹽酸的目的［14］。已知在生理情況下，促胃液素和乙酰膽堿作用于壁細胞時，均可導致細胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，使微管泡結(jié)構(gòu)與分泌小管融合，質(zhì)子泵、Cl－通道和K＋通道遷移［15］，從而壁細胞分泌鹽酸增加，這為Ca2＋與CaM結(jié)合后激活MLCK提供了條件。已有實驗證明F－actin控制著壁細胞的泌酸活動［16］。肌球蛋白的上游分子參與泌酸過程中的囊泡轉(zhuǎn)運［17］，而 MLCK可能是肌球蛋白上游分子之一。由此認為MLCK參與介導了HCL的分泌。MLCK在胃底腺腺細胞分泌過程中的具體機制還有待于進一步證實。

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