呂坤聚 趙 統(tǒng) 蔣悍東

（中國人民解放軍第401醫(yī)院呼吸內(nèi)科 青島266071；1上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科 上海200127）

NF－κB在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。NF－κB靶基因可編碼粘附分子、趨化因子等，它們在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中是必不可少的。VEGF作為目前已知作用最強(qiáng)的血管生成促進(jìn)因子，其與非小細(xì)胞肺癌有著密切的關(guān)系，本實驗研究NF－κB、VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，探討其在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的影響以及它們之間的相關(guān)性。

材料和方法

1．標(biāo)本與資料

收集2009年10月－2010年10月解放軍第四零一醫(yī)院胸外科手術(shù)NSCLC標(biāo)本56例（排除以下患者：手術(shù)之前進(jìn)行過放療或（和）化療者；合并有肺癌以外的其他腫瘤者；組織塊石蠟包埋不充分者）。其中鱗癌30例，腺癌26例。男性38例，女性18例；最大年齡75歲，最小年齡39歲，平均年齡55．1歲。隨機(jī)選擇20例NSCLC癌旁組織。將標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定，脫水、透明、石蠟包埋。組織病理分類及分級由我院病理科醫(yī)生確定，結(jié)合手術(shù)、影像學(xué)檢查（每位病人均有胸部CT、顱腦MRI（或CT）、骨掃描、腹部B超或全身PET－CT）進(jìn)行TNM分期。

2主要試劑

兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人NF－κB P65單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體均購自博世德生物技術(shù)有限公司。顯色試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3主要方法

石蠟包埋的組織塊經(jīng)5μm厚連續(xù)切片，分別做HE染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色采用PV－9000法。步驟如下：脫蠟至水、3mol／L尿素溶液消化、3%過氧化氫溶液封閉、檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原、自然冷卻至室溫、血清封閉、加一抗（稀釋比例1∶200）后4℃過夜、37℃復(fù)溫、加二抗37℃反應(yīng)、DAB顯色、蘇木素復(fù)色、鹽酸酒精分化、脫水透明、中型樹膠封片。用PBS液取代一抗做空白對照。

4結(jié)果判斷

NF－κB P65胞質(zhì)中呈黃色顆粒沉淀為陽性。VEGF胞質(zhì)中呈棕黃色染色顆粒沉淀為陽性。強(qiáng)度計分：通過顯微鏡觀察，0分為陰性；1分為弱陽性，染色為淡黃色；2分為陽性，染色為黃色；3分為強(qiáng)陽性，染色為棕褐色。著色細(xì)胞百分率計分：評定每張切片10個高倍視野計數(shù)著色細(xì)胞百分比：0分為陰性，＜10%；1分弱陽性，10%－25%；2分為陽性，25%－50%；3分為強(qiáng)陽性，＞50%。以陽性細(xì)胞百分率記分和強(qiáng)度記分相加所得總分進(jìn)行判斷，總分0分為陰性，1－2分為弱陽性，3－4分為陽性，5－6分為強(qiáng)陽性。MVD的檢測方法按 Weidner法［1］進(jìn)行。先用低倍（×40倍）鏡下找出三個最高的血管密度區(qū)，再在高倍（×200倍）鏡下計數(shù)CD34染成棕黃色的微血管數(shù)目，結(jié)果用5個200倍視野下的血管數(shù)目的平均數(shù)表示。

5統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17．0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，實驗組與對照組，實驗組內(nèi)分級比較采用χ2檢驗。P＜0．05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1NF－κB P65、VEGF在非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁組織中表達(dá)

NF－κB P65蛋白的陽性表達(dá)主要定位在胞漿（圖1），VEGF蛋白的陽性主要定于胞漿（圖2），在非小細(xì)胞肺癌中NF－κB P65、VEGF的表達(dá)陽性率分別為83．9%（47／56）、80%（45／56），癌旁組織分別為20% （4／20）、30%（6／20）。NF－κB p65、VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的陽性率均高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

圖1 NF－κB P65在肺癌（鱗癌）中呈強(qiáng)陽性．×400倍圖2 VEGF在肺癌（鱗癌）中呈強(qiáng)陽性．×400倍Fig．1NF－κB P65strong expression expression in case．×400Fig．2VEGFstrong expression expression in case．×400

2NF－κB P65、VEGF的表達(dá)與 NSCLC臨床病理間的關(guān)系

在NSCLC組織中NF－κB P65的表達(dá)與患者的年齡、性別、組織類型無相關(guān)性（P＞0．05），但與NSCLC的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移、吸煙史顯著相關(guān)（P＜0．05）。VEGF的表達(dá)與年齡、性別、組織類型、TNM分期、吸煙史無相關(guān)性（P＞0．05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性（P＜0．05）（表1）。

3NF－κB P65、VEGF、MVD的相關(guān)性分析

NF－κB P65、VEGF 陽性表達(dá)肺組織中 MVD評分明顯較NF－κB P65、VEGF陰性表達(dá)肺癌組織高，比較有明顯差異，并明顯相關(guān)（表2）。

表1 NF－κB P65、VEGF表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlation of NF－κB P65and VEGF expressions with clinico pathological characteristics of NSCLC

表2 NF－κB P65、VEGF與 MVD之間的關(guān)系Table 2 Association between NF－κB P65、VEGF and MVD

討 論

NF－κB是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，目前的研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［2］。本研究結(jié)果顯示 NF－κB P65在 NSCLC組織中表達(dá)高于癌旁組織，存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，Jin等采用凝膠蛋白電泳及免疫組化法發(fā)現(xiàn)肺癌組織中 NF－κB P65表達(dá)高于癌旁組織［3］，與上述研究結(jié)果相似。在本次試驗中發(fā)現(xiàn)，在吸煙組、TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期組以及轉(zhuǎn)移組中NF－κB P65表達(dá)明顯高于非吸煙組、TNM分期為ⅠⅡ期組以及無轉(zhuǎn)移組。Zhang等報道稱肺癌組織中NF－κB高表達(dá)提示組織分化更差，更高惡性程度［4］。也曾有報道發(fā)現(xiàn)NF－κB P65在 NSCLC高表達(dá)，提示 NSCLC生存率降低［5］。

VEGF是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管形成因子之一，它可以通過促血管生成參與肺癌浸潤和轉(zhuǎn)移［6］。作者發(fā)現(xiàn)VEGF與年齡、性別、組織類型、TNM分期無相關(guān)性，這與Fortanini等的研究相似［7］。本研究結(jié)果表明NSCLC組織中VEGF表達(dá)陽性率明顯增高，與 MVD呈顯著正相關(guān)，提示VEGF與腫瘤新生血管生成密切相關(guān)，而且VEGF在NSCLC組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移有關(guān)，Yasuhiko等對Ⅰ期肺癌進(jìn)行微轉(zhuǎn)移灶分析，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的原發(fā)癌VEGF表達(dá)陽性率為68．6%，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者僅為31．0%（P＜0．05）。提示VEGF調(diào)控的新生血管的生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切的 關(guān) 系［8］。Yano 等 將 VEGF165cDNA 轉(zhuǎn) 染VEGF低表達(dá)株后種植胸腔，發(fā)現(xiàn)微血管通透性升高，形成胸水［9］。上述研究與作者實驗結(jié)果一致，均提示VEGF是肺癌的轉(zhuǎn)移的一個重要因素。

在腫瘤血管的形成中NF－κB起著核心作用，它通過上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管的形成［10］。本實驗表明NF－κB與VEGF、MVD的表達(dá)有著高度的相關(guān)性，提示NF－κB通過上調(diào)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管的形成。既往研究發(fā)現(xiàn)：NF－κB介導(dǎo)的環(huán)氧合酶2表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子lа表達(dá)和產(chǎn)生VEGF可能是其作用機(jī)制。但NF－κB與VEGF在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中如何相互作用還有待進(jìn)一步研究。

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