韓艷春 劉魯英 張 騫 曹 璋

（濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 煙臺(tái)264003）

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)和最重要的轉(zhuǎn)移途徑，如何檢測(cè)和控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)乳腺癌的防治具有重要意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（vascular endo－thelial growth factor C，VEGF－C）通過(guò)誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，增加淋巴管通透性，促進(jìn)腫瘤淋巴管的形成和發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。有報(bào)道，腫瘤中可能存在絲裂原激活蛋白激酶p38（p38mitogen－actirated protein kinase，p38MAPK）信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控VEGF－C的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［1］。本研究采用免疫組化和Western blot方法檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中VEGF－C和p38MAPK的表達(dá)，探討其表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及意義。

材料和方法

1．研究對(duì)象

收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2007年1月至2010年1月存檔的70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織石蠟標(biāo)本，均為女性，年齡范圍30－75歲，中位47歲。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織32例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。25例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌新鮮組織取自濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2009年1月至2010年1月間外科手術(shù)切除標(biāo)本，其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織13例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織12例，標(biāo)本術(shù)中切除后立即置于－70℃冰凍保存。

2．方法

免疫組織化學(xué)染色（SP）法及結(jié)果判定 兔抗人p38MAPK多克隆抗體和VEGF－C兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。按SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，采用枸櫞酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)，一抗 VEGF－C（工作濃度是1∶100）、p38MAPK（工作濃度是1∶50），DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽(yáng)性的乳腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。VEGF－C和p38MAPK以腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果判斷采用雙盲法［2］，每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，著色強(qiáng)度分為無(wú)色為0分，淺黃色為1分，黃色及棕黃色為2分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為＜10%為0分，10%－50%為1分，＞50%為2分，兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥2記為陽(yáng)性，＜2為陰性。

Western blot法 從保存的乳腺癌組織中提取蛋白，取50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，VEGF－C（1∶500）和p38MAPK （1∶500）抗體4℃孵育過(guò)夜，與相應(yīng)二抗（1∶1000）室溫下孵育2h，ECL顯色，以β－actin作為內(nèi)對(duì)照。結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，行χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．VEGF－C和p38MAPK在兩組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)

70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織 VEGF－C和p38MAPK蛋白均主要在癌細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，其陽(yáng)性率分別為67．0%（47／70）和61．4%（43／70），見(jiàn)圖1A、B。15例癌旁正常乳腺組織中4例p38MAPK有少量微弱表達(dá)，見(jiàn)圖1C。VEGF－C僅3例胞漿中見(jiàn)少量淺黃色顆粒。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。VEGF－C和p38MAPK在38例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為81．6%（31／38）和76．3%（29／38）；VEGFC和p38MAPK在32例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為50%（16／32）和43．8%（14／32）。VEGF－C和p38MAPK在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．005，P＝0．005），見(jiàn)表1。Western blot結(jié)果也表明，VEGFC和p38MAPK在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，見(jiàn)圖2。

表1 VEGF－C和p38MAPK表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系Table 1 Relationship of VEGF－C and p38MAPK expression with lymphatic metastasis in IDC

2．VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)與其他臨床病理特征的關(guān)系

VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌TNM 分期有關(guān)（P＝0．019，P＝0．010），即臨床分期越晚VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率越高。VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腫瘤大小（P＝0．203，P＝0．086）和患者的年齡（P＝0．266，P＝0．087）無(wú)明顯關(guān)系，見(jiàn)表2。

表2 VEGF－C和p38MAPK表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation of VEGF－C and p38MAPK expression to clinicopathological characteristics of breast carcinoma

3．VEGF－C和p38MAPK蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)果表明，70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中VEGF－C和p38MAPK表達(dá)均陽(yáng)性35例；VEGF－C表達(dá)陽(yáng)性而p38MAPK表達(dá)陰性12例；VEGF－C和p38MAPK表達(dá)均陰性15例，VEGF－C和p38MAPK表達(dá)強(qiáng)度相同有50例（71．5%）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，VEGF－C和p38MAPK表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0．383，P＝0．001），見(jiàn)表3。

表3 VEGF－C和p38MAPK表達(dá)的關(guān)系Table 3 Correlation between the expression of VEG－C and p38MAPK

討 論

乳腺癌是血管依賴(lài)性疾病，且乳腺富含淋巴管網(wǎng)，早期即發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。因此，如何檢測(cè)和控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)乳腺癌的防治具有重要意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF－C）于1996年從人前列腺PC23細(xì)胞系中分離純化得出，全長(zhǎng)1997KB，是新發(fā)現(xiàn)的一種與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）同源的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，VEGF－C通過(guò)與其受體VEGFR－3結(jié)合，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷徙，并增加淋巴管的通透性，因而又被稱(chēng)為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在腫瘤的淋巴管形成中起重要作用［3］。趙紅軍等［4］研究表明，VEGF－C在乳腺癌的淋巴管生成中發(fā)揮重要的作用，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。p38MAPK是1993年由Brewster等首先發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)MAPK通路，它能將細(xì)胞外多種刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖遷移和侵襲轉(zhuǎn)移［5］。趙凱等［6］將shRANKL作用乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞后，在引起細(xì)胞遷移和侵襲能力的同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p38MAPK蛋白表達(dá)明顯升高。以上研究結(jié)果顯示，VEGF－C和p38MAPK表達(dá)與人類(lèi)多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移之間具有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VEGF－C和p38MAPK在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且其表達(dá)也與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌TNM分期有關(guān)，提示VEGF－C和p38MAPK可能參與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

腫瘤淋巴管生成和發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移受多種因子的調(diào)控，在此調(diào)控過(guò)程中需要信號(hào)通路的介導(dǎo)。Granata等［7］研究表明，PLA2與其受體結(jié)合對(duì)肺癌細(xì)胞的刺激作用促進(jìn)p38MAPK的活化，同時(shí)VEGF－C表達(dá)升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK特異抑制劑SB203580可降低PLA2誘導(dǎo)的VEGFC表達(dá)。Sasahira等［8］報(bào)道，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)HMGB1、NFkBp65和MIA相互作用使VEGF－C分泌增加，可促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；p38抑制劑可降低VEGF－C表達(dá)，說(shuō)明在人類(lèi)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系VEGF－C的上調(diào)是通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的。另有報(bào)道［9］，在IL－1β誘導(dǎo)的鼠肺 癌 VEGF－C mRNA 和 蛋 白 過(guò) 表 達(dá) 可 被p38MAPK特異性抑制劑SB203580所降低。因此，p38MAPK信號(hào)通路在促進(jìn)VEGF－C的表達(dá)中可能具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化和Western blot證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，并進(jìn)一步對(duì)VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，VEGF－C和p38MAPK蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示p38MAPK信號(hào)通路可能與VEGF－C之間存在交聯(lián)，共同調(diào)節(jié)腫瘤淋巴管的生成，促進(jìn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其可能的機(jī)制是：各種生長(zhǎng)因子等細(xì)胞外信號(hào)作用于腫瘤細(xì)胞膜上的受體，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，使p38MAPK磷酸化，促進(jìn)VEGF－C蛋白表達(dá)，VEGF－C分泌至腫瘤細(xì)胞外，與VEGFR－3結(jié)合，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而增加了癌細(xì)胞進(jìn)入淋巴管密度，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而這一過(guò)程是否有其他因子的參與，確切機(jī)制如何，需要進(jìn)一步相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，VEGF－C和p38MAPK在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中可能起協(xié)同作用，VEGF－C受p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控，參與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。阻斷p38MAPK信號(hào)通路有可能為乳腺癌的抗淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療提供新思路。

圖 版 說(shuō) 明

圖1 A、B p38MAPK、VEGF－C在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)．（SP×400）；C p38MAPK在癌旁正常組織中的表達(dá)．（SP×200）1A：p38MAPK 胞漿（＋）S－P×400；1B：VEGF－C胞漿（＋）S－P×400

圖2 VEGF－C和p38MAPK在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)．（Western blot）A：伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；B：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1A、B Expression of p38MAPK and VEGF－C in breast invasive ductal carcinoma tissue；C Expression of p38MAPK in adjacent normal tissues．（SP×200）1A：p38MAPK cytoplasm（＋）S－P×400；1B：VEGFC cytoplasm（＋）S－P×400

Fig．2Expression of VEGF－C and p38MAPK in breast carcinoma with lymphatic metastasis tissue and without lymphatic metastasis．（Western blot）A：group with lymphatic metastasis；B：group without lymphatic metastasis

［1］Feng Y，Hu J，Ma J，et al．RNAi－mediated silencing of VEGF－C inhibits non－small cell lung cancer progression by simultaneously down－regulating the CXCR4，CCR7，VEGFR－2and VEGFR－3－dependent axes－induced ERK，p38and AKT signalling pathways．Eur J Cancer，2011，47（15）：2353－2363

［2］韓艷春，劉魯英，王霞等．乳腺癌組織中 VEGF－C和uPA的表達(dá)及意義．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2010，26（3）：296－299

［3］Sinn BV，Darb－Esfahani S，Wirtz RM，et al．Vascular endothelial growth factor C mRNA expression is a prognostic factor in epithelial ovarian cancer as detected by kinetic RT－PCR in formalin－fixed paraffin－embedded tissue．Virchows Arch，2009 ，455（6）：461－467

［4］趙紅軍，張延新，杜華貞等．乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中COX－2、VEGF－C和 VEGFR－3的表達(dá)及其意義．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2010，26（5）：613－616

［5］Park SW，Kim HS，Hah JW，et al．Celecoxib inhibits cell proliferation through the activation of ERK and p38 MAPK in head and neck squamous cell carcinoma cell lines．Anticancer Drugs，2010，21（9）：823－830

［6］趙凱，譚群亞，楊翀等．干擾ERK／p－38MAPK信號(hào)通路對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28（2）：311

［7］Granata F，F(xiàn)rattini A，Loffredo S，et al．Production of vascular endothelial growth factors from human lung macrophages induced by group IIA and group X secreted phospholipases A2．J Immunol，2010，184（9）：5232－5241

［8］Sasahira T，Kirita T，Oue N，et al．High mobility group box－1－inducible melanoma inhibitory activity is associated with nodal metastasis and lymphangiogenesis in oral squamous cell carcinoma．Cancer Sci，2008，99（9）：1806－1812

［9］Wang J，Zhang B，Guo Y，et al．Artemisinin inhibits tumor lymphangiogenesis by suppression of vascular endothelial growth factor C．Pharmacology，2008，82（2）：148－155