李鄉(xiāng)南 張麗娜 李寶巖 李建華

（1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室 沈陽(yáng)110001）

肺癌是目前世界范圍內(nèi)引起死亡人數(shù)最多的腫瘤，這可能與患者對(duì)化療藥物敏感性降低有關(guān)［1］。因此，研究肺癌細(xì)胞對(duì)藥物耐受的機(jī)制成為影響臨床治療及患者預(yù)后的關(guān)鍵問(wèn)題。

表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體屬于受體型蛋白酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），是細(xì)胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶活性的一類(lèi)跨膜受體，其活性最早是在癌基因src產(chǎn)物上發(fā)現(xiàn)的。其表達(dá)異常與惡性腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、血管形成、轉(zhuǎn)移、放射敏感性等方面關(guān)系密切，也成為目前抗腫瘤分子靶向研究中關(guān)注最為廣泛、研究最為深入、最有前途的治療靶點(diǎn)之一［2］。

在臨床工作中觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)存在著類(lèi)似纖維樣結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)膠原化的改變，這可能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)，成為導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)相關(guān)因素?，F(xiàn)有研究表明，Ⅰ型膠原（ColⅠ）是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，Ⅳ型膠原（ColⅣ）是構(gòu)成基底膜致密層的主要成分［3］。但腫瘤細(xì)胞中的膠原成分與其耐藥性是否有關(guān)聯(lián)尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)Masson特異性染色和免疫細(xì)胞化學(xué)方法探討EGFR與肺腺癌細(xì)胞膠原化及EMT的相關(guān)性。

材料和方法

1．研究對(duì)象

收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009年1月至2010年6月門(mén)診及病房患者胸腔積液標(biāo)本110例。其中，惡性胸水78例（主要細(xì)胞成分為肺腺癌細(xì)胞），良性胸水（主要細(xì)胞成分為增生上皮細(xì)胞）32例作為對(duì)照。其中男52例，女58例；年齡34－87歲，中位年齡59歲。全部病例結(jié)合臨床病史、經(jīng)影像學(xué)診斷及細(xì)胞病理證實(shí)，其中32例經(jīng)肺部穿刺診斷，46例為有肺癌病史復(fù)發(fā)患者，采集標(biāo)本前未接受任何治療。

2．試驗(yàn)試劑及方法

兔抗人EGFR抗體購(gòu)自福州邁新公司銷(xiāo)售的美國(guó)Maxin公司產(chǎn)品。羊抗人COL1A1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze，公司，鼠抗人TTF－1、E－cadherin、Vimentin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bio Genex公司，采用鏈霉菌抗生物素－過(guò)氧化物酶（streptavidinperoxidase，SP）法，PBS緩沖液代替第一抗體作為空白對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

Masson氏改良染色試劑盒購(gòu)自廈門(mén)邁威生物科技公司。采用Masson氏三色染色法：常規(guī)脫蠟至水；置Bouin液室溫過(guò)夜或56℃1h，流水沖洗至黃色消失，蒸餾水洗；Weigert鐵蘇木精染核10 min，鹽酸乙醇分化，流水沖洗10min，蒸餾水洗；Ⅰ液染2min，蒸餾水洗；Ⅱ液染15min；Ⅲ液染5 min，蒸餾水洗；1%冰乙酸溶液浸洗5min，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

3．切片的制備

收集新鮮胸水標(biāo)本200mL，經(jīng)95%乙醇固定24h后石蠟包埋、切片。

4．結(jié)果的判定

EGFR以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，陽(yáng)性程度判斷：細(xì)胞無(wú)著色或著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)＜10%為（－）；陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)10%－25%為（＋）；26%－50%為（＋＋），≥51%為（＋＋＋）；陽(yáng)性表達(dá)即＋～＋ ＋ ＋。Masson染色結(jié)果：膠原纖維呈現(xiàn)亮藍(lán)色或亮綠色，以細(xì)胞漿出現(xiàn)為陽(yáng)性，判定方法同EGFR。細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色，肌肉和胞質(zhì)紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。每張切片選取10個(gè)高倍視野（×400），對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組數(shù)據(jù)的陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)方法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．EGFR蛋白在胸水內(nèi)細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果

首先，常規(guī)使用液基細(xì)胞薄層方法檢測(cè)胸水中細(xì)胞成分之后，細(xì)胞包埋、切片、HE染色、免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行TTF－1染色，陽(yáng)性表達(dá)證實(shí)為腺癌細(xì)胞（圖1）。此外，進(jìn)行CK5／6、CR／MC、P53免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果全部陰性，排除間皮瘤的可能。腺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)明顯，胞膜和胞質(zhì)著色，偶有核著色，呈棕黃色顆粒外觀（圖2A）。淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、間皮細(xì)胞均不著色。78例惡性胸水中有62例肺腺癌細(xì)胞EGFR呈陽(yáng)性表達(dá)，占79．5%。32例良性胸水中未見(jiàn)細(xì)胞特異性著色。兩種不同性質(zhì)胸水的EGFR陽(yáng)性率具有顯著性差異（P＜0．01）。E－cadherin陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)本與陰性的相比，EGFR的表達(dá)沒(méi)有明顯的差異性。

2．膠原蛋白亞型I在胸水內(nèi)細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果及Masson染色結(jié)果

腺癌細(xì)胞膠原蛋白亞型I在肺腺癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率為32．1%（25／78），陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞漿，呈棕黃色顆粒外觀（圖2B），而在增生的上皮細(xì)胞中不表達(dá)。肺腺癌細(xì)胞Masson染色表達(dá)明顯，胞漿著色，呈亮藍(lán)或亮綠色（圖2C）。其中，異型性明顯（細(xì)胞明顯增大，核大且深染，核仁明顯，染色質(zhì)增粗，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)分泌型空泡）的腫瘤細(xì)胞染色較深，異型性較小的腫瘤細(xì)胞或異型增生上皮細(xì)胞染色較淺或不著色。在78例惡性胸水中有55例肺腺癌細(xì)胞Masson染色呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為70．5%。32例良性胸水中可見(jiàn)反應(yīng)性間皮細(xì)胞Masson染色呈陽(yáng)性表達(dá)，占93．2%，炎性細(xì)胞偶有著色。對(duì)于Vimentin陽(yáng)性表達(dá)的患者，Masson染色的陽(yáng)性率明顯高于Vimentin陰性的患者，從而進(jìn)一步證明腫瘤細(xì)胞膠原化與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的密切關(guān)系（圖3）。

3．肺腺癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)出現(xiàn)膠原化的相關(guān)性分析

在55例Masson染色陽(yáng)性表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞中，EGFR染色結(jié)果陽(yáng)性的51例，陰性4例。在62例EGFR陽(yáng)性表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞中，Masson染色結(jié)果陽(yáng)性54例，陰性8例，兩者的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），但與患者年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（表1）。

表1 EGFR和masson染色在胸水肺腺癌細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性Table 1 Correlation between positive expressions of EGFR and Masson staining in adenocarcinoma cells from pleural fluid

討 論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程［4］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［5］。

最新研究顯示，上皮型的肺癌對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療較間質(zhì)化改變的敏感，提示EGFR表達(dá)可能與肺癌細(xì)胞膠原化有關(guān)，肺癌的EMT狀態(tài)有望成為靶向治療療效的預(yù)測(cè)因素應(yīng)用于臨床［6］。國(guó)外的研究還發(fā)現(xiàn)膠原蛋白I型可以通過(guò)TGF－β信號(hào)通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［7］。這間接提示我們EGFR的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)膠原蛋白的形成有關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)EGFR在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)增高。并且，EGFR的高表達(dá)通常伴隨Masson染色的陽(yáng)性表達(dá)。Masson染色是膠原纖維的特異性染色方法。在肺腺癌細(xì)胞中，異型性明顯（細(xì)胞明顯增大，核大且深染，核仁明顯，染色質(zhì)增粗，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)分泌型空泡）的腫瘤細(xì)胞染色較深，EGFR也通常表達(dá)較好，呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性（＋～＋＋＋）。而對(duì)于腫瘤特征不明顯，異型性較小的腺癌細(xì)胞Masson染色較弱，EGFR表達(dá)呈陰性或弱陽(yáng)性（－～＋）。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，晚期腺癌患者通常對(duì)化療藥物不敏感，產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果及患者預(yù)后。

肺癌患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性可能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生膠原化改變存在某種關(guān)聯(lián)，還需進(jìn)一步探討。

［1］Meyerson M，Carbone D．Genomic and proteomic profiling of lung cancers：lung cancer classification in the age of targeted therapy．J Clin Oncol，2005，23（14）：3219－3226

［2］賈硯寒，黎燕，彭暉等．表皮生長(zhǎng)因子受體家族單克隆抗體耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展．國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2012，39（3）：197－203

［3］陶凱忠，陳爾瑜，丁光宏．膠原纖維的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)．解剖科學(xué)進(jìn)展，1998，4（4）：289－293

［4］李紅方，郝玉增，趙惠民等．Tiam1、VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與微血管生成的關(guān)系．河北醫(yī)藥，2009，31（2）：134－136

［5］Thiery JP．Epithelial－mesenchymal transitions in tumour progression．Nat Rev Cancer，2002，2：442－454

［6］鄧沁芳，周彩存，蘇春霞．非小細(xì)胞肺癌上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化與EGFR突變以及臨床病理特征之間的關(guān)系．腫瘤防治研究，2008，35（4）：258－262

［7］Yasushi Shintani，Masato Maeda，Nina Chaika．Collagen I promotes epithelial－to－mesenchymal transition in lung cancer cells via transforming growth factor－b signaling．Am J Respir Cell Mol Biol，2008，38：95－104