余榮嬌 張 凱＊ 呂正梅 劉 茜 洪 燕

（1安徽中醫(yī)學(xué)院組胚生物學(xué)教研室，合肥230038；2安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，合肥230032）

高脂飲食是非胰島素依賴型糖尿病、心腦血管病、骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤和某些生殖和代謝性疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因素［1］。由于影響性激素水平，所以認(rèn)為高脂飲食也會(huì)影響生殖功能［2］。研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，精子密度降低，活力下降，精子DNA碎片參數(shù)增加［3－5］。近年來(lái)，高脂飲食對(duì)睪丸功能的影響研究較多，但是對(duì)附睪的影響未見(jiàn)報(bào)道。附睪是哺乳動(dòng)物精子成熟、獲能、儲(chǔ)存和保護(hù)精子的重要器官，附睪受損傷將會(huì)影響精子的成熟，降低雄性哺乳動(dòng)物的生育能力。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulatedprotein78，GRP78）和c／EBP同源蛋白（c／EBP homologous protein，CHOP）參與睪丸損傷過(guò)程，影響睪丸功能［6］，但在附睪的損傷中報(bào)道較少。本研究通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠以及褪黑素（melatonin，MT）干預(yù)性處理，觀察附睪組織形態(tài)學(xué)變化及GRP78和CHOP的表達(dá)，探討高脂飲食引起小鼠附睪損傷的可能機(jī)制及MT的治療機(jī)制。

材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

18只C57BL／6J雄性小鼠，其中12只為ApoE基因敲除的C57BL／6J雄性小鼠，6只為普通野生型小鼠（購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，SPF級(jí)）。12只ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為高脂飲食組和MT處理組：高脂飲食組予以高脂飼料（0．5%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、20%蔗糖、59．5%普通飼料）喂養(yǎng)，MT處理組給予高脂飲食外，每天予MT（1mg／kg）灌胃治療。6只野生型小鼠，給予普通飼料喂養(yǎng)，作為對(duì)照組。每組動(dòng)物皆單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。12w后麻醉、處死及取材。

2．藥物和主要試劑

MT購(gòu)自Sigma公司；GRP78、CHOP皆購(gòu)自Bioworld公司；SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司。

3．方法

3．1附睪組織病理學(xué)觀察

取雙側(cè)附睪頭用4%甲醛固定24h，石蠟包埋。常規(guī)切片，切片厚為5μm，HE染色，脫水，透明，封片，×400鏡下觀察附睪組織病理學(xué)變化。

3．2免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽煮沸修復(fù)6－8min；3%H2O2室溫孵育10min，PBS洗5min×3次；正常山羊血清封閉，37℃孵育30min，傾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1－2h，PBS洗5min×3次；滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS洗5min×3次；DAB顯色5－10min；蒸餾水沖洗，脫水，透明，封片。OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（BX51，Japan）攝片。

4．圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析軟件計(jì)算細(xì)胞GRP78表達(dá)的平均光密度，每個(gè)蠟塊切兩張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)高倍鏡視野（×400），每個(gè)視野完整并且不重疊。計(jì)算每個(gè)視野中的CHOP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，拍攝方法同上。數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，統(tǒng)計(jì)比較用SPSS 17．0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料采用方差分析和t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1．附睪組織病理學(xué)

對(duì)照組輸出小管由柱狀纖毛細(xì)胞和和無(wú)纖毛細(xì)胞構(gòu)成。各管腔內(nèi)有大量染色均勻的精子；附睪管主細(xì)胞排列緊密、整齊、細(xì)胞形態(tài)呈高柱狀，胞質(zhì)比較飽滿，細(xì)胞核排列整齊有序，細(xì)胞靠近腔面有大量的纖毛，游離面邊緣整齊（圖1A）。高脂飲食組輸出小管管壁變薄，管腔增大纖毛變短，管腔內(nèi)的精子明顯減少；附睪管退行變，管壁變薄，上皮細(xì)胞胞質(zhì)疏松，纖毛縮短、稀疏、結(jié)構(gòu)不清，游離面邊緣模糊；（圖1B）。MT處理組輸出小管和附睪管結(jié)構(gòu)正常（圖1C）。

2．免疫組化結(jié)果

2．1GRP78蛋白

GRP78主要表達(dá)于附睪上皮細(xì)胞胞質(zhì)，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒。在對(duì)照組的附睪管和輸出小管上皮GRP78蛋白呈較弱表達(dá)，主要分布于近管腔胞質(zhì)（圖2A）。高脂飲食小鼠附睪管和輸出小管上皮細(xì)胞GRP78的表達(dá)上調(diào)，在近管腔側(cè)和基底部的胞質(zhì)都有表達(dá)（圖2B）。MT處理組小鼠附睪管和輸出小管上皮GRP78表達(dá)下調(diào)，主要分布于近管腔胞質(zhì)（圖2C）。GRP78表達(dá)的平均光密度結(jié)果見(jiàn)表1。

2．2CHOP蛋白

CHOP主要表達(dá)于附睪上皮細(xì)胞胞核。對(duì)照組小鼠附睪管和輸出小管中，僅見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核有CHOP蛋白表達(dá)（圖3A）；高脂飲食組小鼠附睪管中，較多細(xì)胞CHOP蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，輸出小管中陽(yáng)性細(xì)胞則較少（圖3B）；MT處理組小鼠附睪管和輸出小管，只有少數(shù)細(xì)胞核有CHOP蛋白的表達(dá)（圖3C）。CHOP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 小鼠附睪CHOP陽(yáng)性細(xì)胞。3A對(duì)照組；3B高脂飲食組可見(jiàn)較多的CHOP陽(yáng)性細(xì)胞；3CMT處理組。SABC×400．標(biāo)尺＝25μmFig．3ACHOP－positive cells in mice epididymis．3A：control mice．3B：more CHOP－－positive cells were seen in high－fat diet mice．3C：mice fed on high－fat diet with additional melaton in treatment．SABC ×400．Bar＝25μm

表1 GRP78和CHOP在附睪中的表達(dá)（n＝6，mean±SD）Table 1 Expression of GRP78and CHOP in the epididymis

討 論

精子發(fā)生最終產(chǎn)生的是一個(gè)高度分化的細(xì)胞——精子。然而，睪丸中產(chǎn)生的精子是不成熟的，只有經(jīng)歷附睪和女性生殖道的睪丸后成熟才具備使卵細(xì)胞受精的能力［7］。高達(dá)40%的男性不育是由于精子成熟紊亂所造成的，附睪微環(huán)境的改變勢(shì)必會(huì)影響精子的成熟，使得了解附睪的功能和精子的成熟變得尤為重要［8］。

內(nèi)質(zhì) 網(wǎng) 應(yīng) 激 （endoplasmic reticulum stress，ERS）是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打亂形成諸如錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集、Ca2＋耗竭和脂質(zhì)合成紊亂等，通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)通路，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的反應(yīng)。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種特異的分子伴侶，屬于熱休克蛋白70家族，在精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞以及附睪上皮細(xì)胞中都有表達(dá)，它能幫助蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的折疊，在精子發(fā)生過(guò)程中和精子的功能中起作用，例如使卵子受精等［9］。但是GRP78表達(dá)上調(diào)也可導(dǎo)致ERS，引起細(xì)胞損傷［10］。研究表明，高脂飲食引起卵母細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞凋亡增加均有ERS的參與［11，12］，ERS 也 參 與 了 鉻 引 起 的 睪 丸 損 傷［13］。 本研究發(fā)現(xiàn)，GRP78蛋白在高脂飲食小鼠輸出小管及附睪管上皮細(xì)胞呈表達(dá)上調(diào)，可能會(huì)激活ERS，造成附睪內(nèi)環(huán)境紊亂，影響精子的成熟。

CHOP／GADD153是ERS的下游蛋白，在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，PERK、ATF6和IRE1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控通路誘導(dǎo)CHOP基因的轉(zhuǎn)錄，CHOP蛋白增加并聚集在細(xì)胞核內(nèi)。Gong等研究發(fā)現(xiàn)［14］，在壬基苯酚誘導(dǎo)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞的ERS中，CHOP基因表達(dá)顯著增加。CHOP的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生［15］。MCCullough證實(shí)［16］CHOP表達(dá)增加可以通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl－2而引起細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，CHOP蛋白在正常對(duì)照組和褪黑素處理組中僅有少量表達(dá)，而高脂飲食小鼠附睪CHOP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，表明轉(zhuǎn)錄因子CHOP被活化，提示高脂飲食時(shí)附睪上皮細(xì)胞發(fā)生ERS，通過(guò)凋亡途徑對(duì)其產(chǎn)生損害。

MT作為一種強(qiáng)抗氧化劑，可以抑制線粒體氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡［17］。有研究表明，MT可以通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和增加抗氧化能力途徑，改變阿霉素對(duì)睪丸毒性損傷［18］。Ji等發(fā)現(xiàn)［19］，MT 可以降低鎘引起的睪丸組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)，從而對(duì)睪丸起到保護(hù)性作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MT處理的小鼠與高脂飲食小鼠相比，附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，GRP78、CHOP蛋白的的表達(dá)明顯下調(diào)，提示MT對(duì)附睪的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制GRP78、CHOP的活化，降低ERS狀態(tài)，從而改善高脂飲食引起的附睪損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食可以通過(guò)GRP78與CHOP通路的激活而引起附睪的損傷。MT減輕高脂飲食引起的附睪損傷，可能是通過(guò)阻止ERS的激活實(shí)現(xiàn)的。這為特發(fā)性不育癥的治療提供了新的思路，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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