楊小丁 程 勇＊ 湯為學(xué) 賈健鋒 羅川栩

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科；2重慶市高校神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶400016）

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，晚期治療效果及預(yù)后極差。通過檢測(cè)結(jié)直腸癌中某些特定基因、蛋白的表達(dá)水平，以期為有效防治結(jié)直腸癌提供理論支持。同源重組（homologous recombination，HR）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞修復(fù)DNA雙鏈斷裂（doubles strand breaks，DSBs）的一種重要方式，高度保真的HR對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用。研究表明同源重組相關(guān)分子缺陷或者過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，同源重組活性增強(qiáng)與腫瘤對(duì)放化療的耐受增加有關(guān)［1］。RAD51蛋白是HR的中心分子，在DNA損傷的修復(fù)過程中發(fā)揮著引導(dǎo)重組交換的關(guān)鍵作用［2］。人乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）參 與 多 個(gè)DNA損傷的修復(fù)通路，對(duì)DSBs的修復(fù)是其中之一［3］。目前在多種腫瘤及細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)RAD51、BRCA1的表達(dá)增高，且在部分腫瘤中其高表達(dá)與預(yù)后相關(guān)［4，5］。本研究以結(jié)直腸癌為研究對(duì)象，檢測(cè)RAD51和BRCA1的蛋白及mRNA表達(dá)水平，分析其與病理特征的關(guān)系，探索二者在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及治療過程中的作用。

材料和方法

1．材料

1．1臨床標(biāo)本

選取2011年3－7月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌灶及癌旁正常組織（距離癌邊緣約10cm）各42例，其中男20例，女性22例，年齡24－83歲，平均61．43±12．91歲，結(jié)腸癌16例，直腸癌26例；術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療；術(shù)后病理診斷證實(shí)高分化7例，中低分化35例；TNM分期：Ⅰ＋Ⅱ期18例，Ⅲ＋Ⅳ期24例；有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無明顯轉(zhuǎn)移灶20例。標(biāo)本取兩份分別放入4%多聚甲醛和液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2主要試劑

免疫組化SP試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），兔抗人RAD51單克隆抗體（美國(guó)Epitomics公司），兔抗人BRCA1多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。RNAiso Puls總RNA提取試劑及RT－PCR主要相關(guān)試劑PrimeScript RT－PCR Kit和Premix Taq（大連寶生物工程有限公司）。RAD51、BRCA1和人β－actin引物由大連寶生物工程有限公司合成。RAD51上游：5＇－GTGGAATTGAGACTGGATCTATCA－3＇，下 游：5＇－GATAAAGGAGCTGGGTCTGGT－3＇，退火溫度55℃，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 度 為 273bp；BRCA1 上 游：5＇－AAGAACCAGGAGTGGAAAGGTC－3＇，下游：5＇－TTCAGGGTCATCAGAGAAGAGG－3＇，退火溫度56℃，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 263bp。 人 β－actin 上 游：5＇－GACCCAGATCATGTTTGAGACC－3＇，下游：5＇－ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG－3＇，退火溫度55℃，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為594bp。

2．方法

2．1RNA提取及RT－PCR檢測(cè)

按照RNAiso Puls試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄RNA，PCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃5min，85℃5sec；以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增各基因，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，退火溫度30s，72℃30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后1次循環(huán)后72℃延伸5min。利用2．0% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描成像，Quantity One軟件分析各條帶的吸光度值，以目的基因與內(nèi)參β－actin吸光度的比值作為BRCA1和RAD51基因mRNA的表達(dá)量。

2．2免疫組織化學(xué)

采用SP法檢測(cè)RAD51，BRCA1蛋白的表達(dá)。4% 多聚甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，4μm厚切片，脫蠟，水化組織切片，0．1% 枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)，SP免疫組化染色，二甲苯透明中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。RAD51，BRCA1抗體1∶150稀釋，染色步驟按說明書進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果判斷以每個(gè)標(biāo)本等距（4μm）切片5張，光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片，以出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性?；谌旧栃詳?shù)及著色強(qiáng)度評(píng)定免疫染色分級(jí)［6］。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野（400x）對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分：①根據(jù)染色細(xì)胞數(shù)占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率，＜5%為0分，5%－25%為1分，26%－50%為2分，51%－75%為3分，＞75%為4分；②依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)予無染色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩者的乘積為陽性等級(jí)。0分為陰性（－），1－4分為弱陽性（＋），5－8分以上為陽性（＋＋）。9－12分以上為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用spss17．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用Wilconxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)和Kruskal－Wallis秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用非參數(shù)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．RAD51和BRCA1在組織中的表達(dá)結(jié)果

RAD51在結(jié)直腸癌的胞核及部分胞質(zhì)中表達(dá)（33例，78．6%），染色呈黃色或棕黃色顆粒，在正常組織中不表達(dá)（35例，83．3%）或低表達(dá)（7例，16．7%）；BRCA1在結(jié)直腸癌組織的細(xì)胞核和胞質(zhì)中均見表達(dá)（30例，71．4%），在部分（18例，42．9%）正常組織中表達(dá)（圖1）。結(jié)直腸癌中 RAD51mRNA（0．51±0．26）和BRCA1mRNA（0．70±0．96）的值較兩者在正常組織中mRNA（0．10±0．22）高（P＜0．01）圖2，表1。

2．RAD51、BRCA1在各組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

在結(jié)直腸癌癌旁正常組織中，RAD51、BRCA1兩者的表達(dá)不存在相關(guān)性（蛋白：r＝0．181，P＞0．05；mRNA：r＝0．204，P＞0．05）；在結(jié)直腸癌組織中，RAD51、BRCA1的表達(dá)成明顯正相關(guān)（蛋白：r＝0．731，P＜0．01mRNA：r＝0．572，P＜0．01）。表1。

表1 RAD51和BRCA1在結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中的表達(dá)Table 1 The expression of RAD51and BRCA1in colorectal cancer tissues and adjacent normal colorectal tissues

圖1 如圖為選取的具有代表性的A、B、C、D4例標(biāo)本中BRCA1和RAD51的表達(dá)情況；圖中A號(hào)標(biāo)本為正常組織，B，C，D為結(jié)直腸癌組織；A1、B1、C1、D1為RAD51的表達(dá)，A2、B2、C2、D2為BRCA1的表達(dá)（SP×400）Fig．1Expression of proten RAD51（A1，B1，C1，D1）and BRCA1（A2，B2，C2，D2）in colorectal cancer．A is normal tissue，B，C，D is colorectal cancer．（SP×400）

圖2 RT－PCR檢測(cè) RAD51mRNA （A）、BRCA1mRNA（B）在癌旁正常組織（N1，N2，N3）和癌組織（T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7）中的表達(dá)Fig．2RT－PCR detected the expression of BRCA1mRNA（A）and RAD51mRNA（B）in colorectal cancer（T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7）and adjacent normal colorectal tissues（N1，N2，N3）

3．Rad51和Brca1與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

結(jié)直腸癌中RAD51、BRCA1的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。表2。

表2 RAD51、BRCA1蛋白及其mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation of the protein expression of RAD51and BRCA1 with clinicopathologic features of colorectal cancer

討 論

同源重組功能的正常對(duì)維持細(xì)胞遺傳的穩(wěn)定和正常的生命功能具有重要作用，但是當(dāng)同源重組功能過度活躍則會(huì)引起異常的基因重組，從而造成基因的不穩(wěn)定，研究認(rèn)為這種基因的不穩(wěn)定可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一［2］。RAD51是大腸桿菌RecA蛋白的同系物，具有DNA依賴性ATP激酶活性，在DNA損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮著引導(dǎo)重組交換的關(guān)鍵作用［7］。BRCA1參與 HR修復(fù)DSBs的過程主要在早期發(fā)揮作用，BRCA1先于RAD51蛋白聚集到DSBs位點(diǎn)使RAD51磷酸化，其作用相當(dāng)于損傷檢測(cè)分子［8］，感應(yīng)DNA損傷，并將信號(hào)傳遞給下游的修復(fù)效應(yīng)器［3］。BRCA1與同源重組的必需成分RAD51共同位于有絲分裂細(xì)胞核聚集點(diǎn)（nuclear foci）是BRCA1參DNA損傷的證據(jù)［9］。BRCA1和RAD51參與DNA損傷的修復(fù)過程可概括為：DNA損傷后，BRCA1和其他分子構(gòu)成的復(fù)合體感受DNA損傷反應(yīng)，并將此信號(hào)傳遞給下游基因，RAD51接受DSBs信號(hào)，并啟動(dòng)HR對(duì)DSBs進(jìn)行修復(fù)。

本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌中RAD51和BRCA1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)均較正常結(jié)直腸組織升高，與性別、年齡、分化程度、TNM 分期等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但二者的表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中成明顯的正相關(guān)。RAD51和BRCA1的表達(dá)與臨床病理特征無相關(guān)性，可能與標(biāo)本的數(shù)量不夠有關(guān)；但二者構(gòu)成的信號(hào)通路在結(jié)直腸癌中的活性是增加的，我們推測(cè)以RAD51為中心分子的HR通路的活性增加可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

很多傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物包括烷化劑、DNA交聯(lián)劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗代謝藥物等都是通過直接或間接造成不同形形式的DNA損傷來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。其中DSBs是最嚴(yán)重的致死性損傷，腫瘤細(xì)胞中同源重組基因表達(dá)增加，導(dǎo)致同源重組對(duì)DSBs的修復(fù)能力增強(qiáng)，造成腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)降低HR相關(guān)分子的表達(dá)水平，可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。Ito等［10］以RAD51為靶點(diǎn)，在多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中利用siRNA下調(diào)RAD51的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增高；類 似 的，Tsai等［11］在 非 小 細(xì) 胞 肺 癌 轉(zhuǎn) 染RAD51siRNA后，癌細(xì)胞RAD51表達(dá)下調(diào)，腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性明顯增加。同樣，在BRCA1缺陷腫瘤細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞對(duì)交聯(lián)劑的敏感性增加；而高表達(dá)BRCA1的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性增加［1］；另外，BRCA1缺失的細(xì)胞顯示出 RAD51介導(dǎo)的染色體DSBs同源重組修復(fù)缺陷［12］。這些研究結(jié)果提示BRCA1、RAD51參與的HR對(duì)DNA損傷修復(fù)在化療耐受中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中BRCA1和RAD51的表達(dá)水平均較正常組織高，且兩者表達(dá)水平呈明顯相關(guān)性。我們推測(cè)在結(jié)直腸癌中，BRCA1和RAD51高表達(dá)引起HR活性增加，從而對(duì)化療藥物造成的DSBs的修復(fù)能力增強(qiáng)，引起腫瘤細(xì)胞耐藥，這可能是目前臨床化療效果令人不滿意的原因之一。但是，二者高表達(dá)對(duì)腫瘤化療耐藥性的更多更確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜合文獻(xiàn)及本次研究結(jié)果，我們推測(cè)BRCA1、RAD51參與的HR通路可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)。盡管目前對(duì)于BRCA1，RAD51以及HR修復(fù)通路在腫瘤發(fā)生及治療中所起的作用已經(jīng)有大量的研究，但很多確切機(jī)制仍不清楚。進(jìn)一步明確BRCA1、RAD51以及HR修復(fù)三者之間參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及如何調(diào)節(jié)BRCA1、RAD51的表達(dá)水平以適應(yīng)腫瘤治療的需要，將成為值得進(jìn)一步深入研究的問題。

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