張紀(jì)紅 董會卿

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘疾病，其病因尚未明確，目前傾向認(rèn)為是自身免疫相關(guān)性疾病。MS的動物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠研究發(fā)現(xiàn)CD4＋T淋巴細(xì)胞在EAE起病及進(jìn)展中均有重要作用［1］；Th1及Th17細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且分泌細(xì)胞因子導(dǎo)致髓鞘脫失及軸索喪失［2］。CD8＋T淋巴細(xì)胞在MS發(fā)病中也有重要作用，可以殺傷膠質(zhì)細(xì)胞、暴露／橫斷軸索、增加血管通透性、促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡［2］。T淋巴細(xì)胞增殖數(shù)量與患者擴(kuò)展殘疾狀態(tài)評分（expanded disability status scale，EDSS）及復(fù)發(fā)次數(shù)呈正相關(guān)，與緩解期長短呈負(fù)相關(guān)［3］。T淋巴細(xì)胞的免疫活動基本通過T淋巴細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）實(shí)現(xiàn)，因此可以通過監(jiān)測TCR來監(jiān)測MS患者的免疫狀態(tài)。

1 TCR

T淋巴細(xì)胞起源于骨髓多能造血干細(xì)胞，多能造血干細(xì)胞發(fā)育為前T淋巴細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到胸腺完成成熟過程，其中TCR隨機(jī)重排，產(chǎn)生可以識別多種不同抗原的TCR。通常情況下，體內(nèi)表達(dá)某一特異性TCR的T淋巴細(xì)胞克隆僅占總T淋巴細(xì)胞庫的1／（104～105），其被相應(yīng)抗原激活后克隆擴(kuò)增產(chǎn)生大量效應(yīng)細(xì)胞，后者離開淋巴器官隨血液循環(huán)到達(dá)相應(yīng)部位。

TCR表達(dá)于所有T淋巴細(xì)胞表面，由αβ或γδ兩條肽鏈構(gòu)成，前者占成熟T淋巴細(xì)胞的90%～95%。每條鏈分為可變區(qū)（variable region，V區(qū)）與恒定區(qū)（constant region，C區(qū)），抗原特異性存在于V區(qū)，V區(qū)上互補(bǔ)決定區(qū)（complementarydeterminingregion，CDR）決定TCR的抗原特異性，其中CDR3變異最大。TCRβ鏈基因位于7號染色體的7q32-35區(qū)，約有67個基因，其中47個有功能的基因被分為23個功能性基因家族。

2 TCRβ鏈可變區(qū)（TCRVβ）實(shí)的驗(yàn)室研究方法

2.1 PCR方法 CDR3譜型分析［4］是最常用的方法。以流式細(xì)胞儀等方法從患者的腦脊液或外周血中分離出T淋巴細(xì)胞，獲取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TCRVβ引物（熒光標(biāo)記）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，產(chǎn)物在丙烯酰胺凝膠上電泳，用影像熒光分析儀記錄分析。健康人可形成8～10個條帶并呈正態(tài)分布，MS患者可出現(xiàn)1個或多個擴(kuò)增條帶。從凝膠上獲取擴(kuò)增條帶，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增（為減少誤差，一般擴(kuò)增5個循環(huán)），用基因掃描軟件進(jìn)行分析，獲得單峰圖像者為單克隆性，有1個主峰及少數(shù)次主峰者為寡克隆性，有多個峰而無明顯主峰者為多克隆性。另外，用于TCRVβ研究還有單克隆抗體方法［5］，目前采用TCRVβ單克隆抗體試劑與樣本特異性抗原抗體反應(yīng)，之后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析即可檢測出該樣本表達(dá)的TCRVβ并計(jì)算出表達(dá)水平。

2.2 動物實(shí)驗(yàn) TCRVβ的一些研究是在EAE動物模型上進(jìn)行的。有研究者在小鼠EAE形成過程中觀察TCRVβ變化，發(fā)現(xiàn)其淋巴結(jié)、脾、脊髓中有 TCR Vβ8.2及 Vβ16克隆性擴(kuò)增，在出現(xiàn)癥狀前即出現(xiàn)，癥狀消失恢復(fù)至正常時(shí)消失［6］。轉(zhuǎn)基因TCRVβ6（鼠8.6）的T淋巴細(xì)胞有中樞性及周圍性免疫耐受；轉(zhuǎn)基因Vβ8（鼠8.8）的T淋巴細(xì)胞則逃離中樞性及周圍性免疫耐受，并對堿性髓鞘蛋白（myelin basic protein，MBP）79－87發(fā)生反應(yīng)而大量增殖［7］。

動物模型的遺傳背景與人類有一定差距，而且人MS患者發(fā)病也受到環(huán)境、心理等因素影響，因此對MS患者TCRVβ具體表現(xiàn)的研究仍有待于臨床研究。

3 臨床研究

自20世紀(jì)80年代末即有TCRVβ相關(guān)研究，到目前為止，許多TCRVβ相關(guān)研究，多針對免疫相關(guān)疾病如風(fēng)濕病、白血病、腫瘤、乙肝等傳染病及MS等。MS患者不論處于哪個階段，如臨床孤立綜合征（clinically isolated syndrome，CIS）、臨床剛確定的MS或惡化進(jìn)展階段，其TCRVβ的表達(dá)均與健康人存在顯著不同。

3.1 健康人的TCRVβ表現(xiàn) T淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中，TCRVβ基因隨機(jī)重排，健康人TCRVβ一般呈多樣性，不存在擴(kuò)增的 TCRVβ［8－9］。但有些健康人會有1個或以上TCRVβ克隆性擴(kuò)增［10］，并與年齡有一定關(guān)系，20～30歲者無克隆性擴(kuò)增，40～50歲者會有1～2個克隆性擴(kuò)增，其中TCRVβ9克隆性擴(kuò)增較常見［4］。健康人克隆性TCRVβ擴(kuò)增的T淋巴細(xì)胞對MBP不會發(fā)生反應(yīng)［11］，這提示健康人的TCRVβ擴(kuò)增針對的是非MS抗原或被免疫調(diào)節(jié)機(jī)制所控制，這種現(xiàn)象可能與年齡較大者所接觸的病原體及疫苗接種等較多有關(guān)。

3.2 不同MS臨床分型的TCRVβ表現(xiàn) MS不同臨床分型的研究目前尚處于探索階段，不同臨床分型MS患者的TCRVβ表現(xiàn)有所不同，疾病緩解期也可見TCRVβ克隆性擴(kuò)增，長時(shí)間緩解后可恢復(fù)到正常［4］。糖皮質(zhì)激素（激素）及免疫調(diào)節(jié)劑對T淋巴細(xì)胞均有影響。多數(shù)研究中要求采集標(biāo)本前應(yīng)至少3個月［12］（也有的研究要求6周即可［8］）未使用激素治療；從未接受免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑［12］，也有研究要求前3個月未使用免疫抑制劑即可［10］。

3.2.1 CIS：Mandel等［13］的研究中，12例 CIS患者均于首發(fā)癥狀出現(xiàn)3個月內(nèi)采集外周血，用髓磷脂抗原刺激40～45d，其T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)TCRVβ6-Vβ9克隆性擴(kuò)增，與健康對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Démoulins等［14］的研究中僅1例表現(xiàn)為CIS，其腦脊液TCRVβ有克隆性擴(kuò)增，其中TCRVβ13、Vβ15、Vβ20-23為單克隆性，TCRVβ7、Vβ11、Vβ12為寡克隆性；其外周血TCRVβ無克隆性擴(kuò)增，用 MBP84－102刺激6d后，TCRVβ8、Vβ9、Vβ13呈單克隆性擴(kuò)增，另有數(shù)個TCRVβ為寡克隆性擴(kuò)增；用 MBP139－164刺激6d后未出現(xiàn)單克隆性擴(kuò)增的TCRVβ；用人源化 MBP刺激6d后，TCRVβ13呈單克隆性擴(kuò)增［14］。

3.2.2 復(fù)發(fā)－緩解型 MS（relapsing-remitting MS，RRMS）：Biegler等［12］的研究中，4例 RRMS患者均至少有1個主要克隆性TCRVβ存在（占所有受體的10%以上），但個體差異較大。CD4＋及CD8＋T淋巴細(xì)胞的 TCRVβ4、Vβ5、Vβ7、Vβ9及 Vβ11均明顯高表達(dá)，TCRVβ3及 Vβ27明顯低表達(dá)［12］。另一項(xiàng)研究中有9例RRMS患者，其TCRVβ5.2、Vβ8、Vβ12.2、Vβ16及 Vβ21均呈明顯克隆性擴(kuò)增［10］。

澳大利亞的一項(xiàng)研究對較多報(bào)道的克隆性擴(kuò)增的TCRVβ在MS患者與健康人之間進(jìn)行比較［15］，在 122 例 RRMS 與 96 名 健 康 人 的TCRVβ8.1、Vβ11、Vβ6.5、Vβ8.1、Vβ10.1、Vβ15.1及 Vβ3.1 的表達(dá) 中，兩 組 TCRVβ8.1、Vβ10.1、Vβ15.1及Vβ3.1均有克隆性擴(kuò)增，但擴(kuò)增水平不同，患者組擴(kuò)增程度更高，以TCRVβ8.1擴(kuò)增最顯著，其次為 TCRVβ8.1／Vβ3.1［15］。

3.2.3 繼 發(fā) 進(jìn) 展 型 MS（secondary－progressive MS，SPMS）：對1例SPMS患者尸檢發(fā)現(xiàn)腦中急、慢性期病灶、脊髓病灶及表觀正常白質(zhì)中均有TCRVβ克隆性擴(kuò)增［16］。與慢性期及正常表觀白質(zhì)相比，急性病灶的TCRβ鏈的表達(dá)相對更多［16］。

對83例高加索SPMS患者的研究發(fā)現(xiàn)，與197例健康高加索人相比前者的TCR Vβ8.1及Vβ11顯著性克隆性擴(kuò)增，并使罹患MS的相對風(fēng)險(xiǎn)增加4.06倍［17］。另一項(xiàng)針對3例SPMS患者的研究發(fā)現(xiàn)其 TCRVβ15、Vβ17、Vβ18、Vβ19呈克隆性擴(kuò)增［10］。

3.2.4 原發(fā)進(jìn)展型 MS（primary－progressive MS，PPMS）：Matsumoto等［4］的研究中有42例 MS患者，其中 RRMS 35例、PPMS 2例、SPMS 5例，采血時(shí)間距發(fā)病6個月至15年，發(fā)現(xiàn)無克隆性擴(kuò)增患者4例均為20～30歲復(fù)發(fā)階段的RRMS患者，其余患者均有至少1個克隆性擴(kuò)增的TCRVβ，以TCRVβ5.2最常見，其次為 TCRVβ1、Vβ9、Vβ11及 Vβ24；與健康人相比，TCRVβ5.2及 Vβ24的擴(kuò)增最顯著；腦脊液T淋巴細(xì)胞也有Vβ5.2克隆性擴(kuò)增［4］。

一項(xiàng)研究中用 TCRVβ5.2／6.5／13.1三聯(lián)多肽治療23例從未接受治療的MS患者，1年后10／11例 RRMS、3／3例 PPMS、6／9例SPMS患者病情無加重并且體內(nèi)免疫活動下降，1例RRMS及3例SPMS患者病情有進(jìn)展［18］。該研究表明不同類型的MS患者可能存在相同TCRVβ克隆性擴(kuò)增，但仍需要后續(xù)研究進(jìn)一步明確。

3.2.5 進(jìn)展復(fù)發(fā)型 MS（primary-relapsing MS，PRMS）：該類型發(fā)病率較低，對其TCRVβ研究較少。一項(xiàng)研究以患者的健康親屬為對照，發(fā)現(xiàn)DRw15＋PRMS患者（DRw15的基因組名為HLA-DRBI＊1501）的 TCRVβ8-Vβ11基因表達(dá)顯著增多，TCRVβ1-Vβ8在 DRw15－PRMS患者中顯著增多［19］。這項(xiàng)研究表明，患者的遺傳背景不同其擴(kuò)增的TCRVβ可能也不相同。

至今未有針對MS分型特異性TCRVβ的報(bào)道。Laplaud等［10］報(bào)道，SPMS與 RRMS克隆性擴(kuò)增的TCRVβ可能無差異，但RRMS患者克隆性擴(kuò)增數(shù)目更多且擴(kuò)增程度更顯著；克隆性擴(kuò)增的均數(shù)在 RRMS為3.2±3.1，在 SPMS為1.3±1.0［8－9］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，隨著臨床病情的加重，TCRVβ克隆性擴(kuò)增數(shù)目及擴(kuò)增程度均增加［11］，但其具體關(guān)系仍有待于進(jìn)一步研究明確。

3.2.6 MS TCRVβ表現(xiàn)與視神經(jīng)脊髓炎（NMO）的比較：Warabi等［9］對11例 NMO患者（緩解-復(fù)發(fā)病程）、13例RRMS患者、8例SPMS患者（病程大于8年）及25名健康人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NMO、MS患者及健康人均有克隆性擴(kuò)增的TCRVβ，但克隆性擴(kuò)增的數(shù)目不同，擴(kuò)增的均數(shù)MNO為6.0±3.2，MS患者為2.5±2.7，健康人為0.9±1.1。與MS相比，TCRVβ1及TCRVβ13在NMO患者中有更高的擴(kuò)增，克隆性擴(kuò)增的TCRVβ數(shù)目與NMO患者EDSS有相關(guān)性［9］。

3.3 治療對MS患者TCRVβ的影響 MS的治療方法有激素、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑治療及造血干細(xì)胞移植等。目前僅有觀察醋酸格拉替雷（glatiramer acetate，GA）及造血干細(xì)胞移植治療前后TCRVβ變化的研究報(bào)道。

Berthelot等［20］報(bào)道，10例RRMS患者與7名健康者人每日皮下注射GA，10例患者在GA治療前均有TCRVβ克隆性擴(kuò)增，分別于治療后3個月、24個月及34個月再次采集樣本分析，發(fā)現(xiàn)克隆性擴(kuò)增的TCRVβ仍存在，擴(kuò)增程度有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該研究提示GA對MS的治療作用可能不是通過T淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。

Dubinsky等［21］的研究中，4例 MS患者移植前均有寡克隆性擴(kuò)增的TCRVβ，自體造血干細(xì)胞移植后隨訪其TCRVβ變化，3例寡克隆性擴(kuò)增的TCRVβ持續(xù)存在，并呈多態(tài)性增加；1例患者寡克隆性擴(kuò)增的TCRVβ在移植后2年呈現(xiàn)多態(tài)性。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，自體造血干細(xì)胞移植后至少需要兩年克隆性擴(kuò)增的TCRVβ才恢復(fù)到正常的多態(tài)性［22］。

MS患者TCRVβ的研究傾向認(rèn)為MS患者TCRVβ會有克隆性擴(kuò)增，其擴(kuò)增的TCRVβ各研究發(fā)現(xiàn)有一定差異，不同患者之間也有異質(zhì)性，其差異性可能與研究的樣本量較小有關(guān)。

TCRVβ對于監(jiān)測MS患者的臨床病程有一定意義，新的克隆性擴(kuò)增TCRVβ的出現(xiàn)與強(qiáng)化病灶的出現(xiàn)相關(guān)［10］，病情穩(wěn)定患者克隆性擴(kuò)增的TCRVβ不會發(fā)生改變，原來TCRVβ的進(jìn)一步擴(kuò)增或新克隆性擴(kuò)增TCRVβ的出現(xiàn)可能預(yù)示著疾病復(fù)發(fā)。

國外已有將常見克隆性擴(kuò)增的TCRVβ識別肽制作成疫苗并用于臨床試驗(yàn)，并顯示了一定的療效及安全性。國內(nèi)尚無MS的TCRVβ的研究報(bào)道，考慮到種族的差異性，我國 MS患者TCRVβ的表現(xiàn)可能不同，研究中國人MS患者TCRVβ具有重要意義并且是亟需的。

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