林 杭 王偉文 吳渝憲 王 俊 郁 可 楊政輝

成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 成都 610083

本研究有利于闡明tau蛋白過度磷酸化參與阿爾茨海默病發(fā)展的具體機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組 20只2月齡健康雄性Wistar大鼠購于四川省醫(yī)學實驗動物研究所，體質量150．2～180g，實驗分為實驗組（AD模型組）和對照組。實驗組：連續(xù)6周每天腹腔內(nèi)注射D－半乳糖50mg／kg，第4周末雙側海馬內(nèi)注射4μg Aβ1－40（以生理鹽水溶解）。對照組：連續(xù)6周腹腔內(nèi)注射生理鹽水1mL／kg，第4周末雙側海馬內(nèi)注射生理鹽水各1μL。

1．2 實驗方法 將實驗室的溫度控制在18～22℃，將2組實驗對象分別快速斷頭，用刀片小心劃開大腦并取出海馬半腦，快速將海馬半腦粘貼在已準備好的切片機載物臺上，然后將其放入已備好的0～4℃人工冰水腦脊液（以5%二氧化碳和95%氧氣飽和）中。啟動切片機，將海馬半腦切成400 μm厚度薄片。將切好的海馬薄片轉至孵槽（孵槽溫度為37℃，孵槽內(nèi)為95%氧氣和5%二氧化碳飽和的人工腦脊液）孵育1h，取出薄片在室溫下繼續(xù)孵育1h。將海馬薄片移至記錄槽中，以2mL／min的流速持續(xù)灌注人工腦脊液以及出入水管道，循環(huán)液容積設置為50mL，利用拉制儀將硅硼玻璃管拉制成記錄電極，電極電阻3．5～5MΩ。全細胞記錄采用膜片鉗放大器，電刺激脈沖的給出及電信號的采集均通過計算機程序來完成。

1．3 觀察指標 記錄電極與細胞封接、破膜、穩(wěn)定15min后，記錄40min mEPSCs，觀察2組mEPSCs頻率、幅值、半衰期以及上升時間、曲線下面積的變化，并進行比較。

1．4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 2組mEPSCs頻率比較 實驗組mEPSCs頻率（0．043±0．002）Hz，對 照 組 （0．167±0．006）Hz，2 組 比 較，t＝21．35，P＜0．05。

2．2 2組幅值比較 實驗組幅值（7．458±0．381）pA，對照組（14．054±0．356）pA，2組比較，t＝25．62，P＜0．05。

2．3 2組半衰期比較 實驗組半衰期（6．724±1．331）ms，對照組（13．289±2．325）ms，2組比較，t＝31．36，P＜0．05。

2．4 2組上升時間比較 實驗組上升時間（7．458±0．381）ms，對照組（14．054±0．356）ms，2組比較，t＝19．67，P＜0．05。

2．5 2組曲線下面積比較 實驗組曲線下面積（118．903±37．054）pAms，對照組（321．334±87．542）pAms，2組比較，t＝43．45，P＜0．05。

3 討論

3．1 Tau蛋白過度磷酸化及神經(jīng)毒性 在阿爾茨海默病患者的腦組織內(nèi)有3種Tau蛋白，分別是細胞質正常的Tau蛋白、過度磷酸化的Tau蛋白以及聚集成PHF的Tau蛋白。其中PHF－Tau蛋白中已經(jīng)由各國學者相繼鑒定出多個磷酸化位點［2］，這些位點多數(shù)位于PHF－Tau蛋白的PRD位置和C端末區(qū)，只有極少量的位于MBD區(qū)，在這些位點上大多數(shù)是蘇氨酸和絲氨酸的磷酸化，Tau蛋白在MBD區(qū)發(fā)生磷酸化可調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性，尤其是產(chǎn)生在Ser262及Ser356兩個位點上的磷酸化將顯著抑制Tau蛋白的生物學功能，可使Tau蛋白和微管構象發(fā)生改變，從而導致細胞骨架破壞，使微管解聚。另有研究顯示，F(xiàn)yn、Syk、Lck和c－Abl都參與了絡氨酸殘基的磷酸化［2－3］。在病理狀態(tài)下，也就是阿爾茨海默病患者Tau蛋白發(fā)生了過度磷酸化，Tau蛋白的磷酸化程度受多種蛋白激酶調(diào)節(jié)，在Tau蛋白磷酸化過程中起主要催化作用的激酶有脯氨酸指導的蛋白激酶（PDPK）和非脯氨酸指導的蛋白激酶（non－PDPK），PDPK主要磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的Ser／Thr、pro位點，non－PDPK主要磷酸化絲／蘇氨酸的Ser／Thr、X位點。有研究認為，阿爾茨海默病發(fā)病的早期機制是Tau蛋白的過度磷酸化，因NFT尚未形成時，有學者研究發(fā)現(xiàn)已出現(xiàn)神經(jīng)細胞的丟失，且患者的記憶和認知功能出現(xiàn)了損傷，這就說明Tau蛋白過度磷酸化在阿爾茨海默病發(fā)生的過程中起關鍵作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過度磷酸化的Tau蛋白，不僅不能促使微管組裝，而且能抵抗蛋白水解酶的作用，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，F(xiàn)ulga的研究還發(fā)現(xiàn)磷酸化使Tau蛋白大量聚集到肌動蛋白上，因此，過度磷酸化的Tau蛋白有可能轉運到樹突棘與樹突棘上的肌動蛋白相互作用，Tau蛋白通過這種途徑使突觸后AMPA和NMDA受體發(fā)生了改變，導致突觸傳遞效能降低，甚至突觸丟失，從而使認知功能受損［4］。Thiese等［5］2007年發(fā)現(xiàn)Tau蛋白過度磷酸化引起了樹突棘的形態(tài)改變和丟失，這些研究均表明Tau蛋白過度磷酸化也許改變了突觸的結構和功能，使突觸傳遞效能降低，突觸結構和功能的改變會導致阿爾茨海默病的發(fā)生。

3．2 Tau蛋白過度磷酸化對微興奮性突觸后電流的作用腦內(nèi)海馬的組織結構跟其他腦內(nèi)部分的結構略有不同，海馬組織內(nèi)錐體系統(tǒng)按照層狀結構整齊排列，其傳出纖維和傳入纖維相對來說比較單一，是神經(jīng)電生理研究常用的研究部分，mEPSCs反映了微小興奮性突觸在未受外界刺激的情況下自發(fā)進行的電流活動，mEPSCs的頻率大小主要反映了突觸前谷氨酸的釋放量，mEPSCs的幅值主要反映了突觸后膜接受的情況。本研究發(fā)現(xiàn)，過度磷酸化的Tau蛋白組，其

mEPSCs的頻率大小、幅值、半衰期、上升時間、曲線下面積均小于未發(fā)生過度磷酸化的Tau蛋白組，說明Tau蛋白過度磷酸化后能減少突觸后電流的產(chǎn)生，從而從神經(jīng)電生理的角度降低了突觸的興奮性，進而降低了患者的記憶力，加速了細胞的凋亡。

［1］Wang JZ，Grundke－Iqbal I，Igbal K．Kinase and phosphatases and tau sites involved in Alzheimer neurofirillary degeneration［J］．Eur J Neurosci，2007，25：59－68．

［2］Zheng－Fischhfer Q，Biernat J，Mandelkow EM，et al．Sequential phosphorylation of Tau by glycogen synthase kinase－3and protein kinase A at Thr212and Ser214generates the Alzheimer－specific epitope of antibody AT100and requires a paired helical filament－like conformation［J］．Eur J Biochem，1998，252：542－552．

［3］Ewers M，Buerger K，Teipel SJ，et al．Multicenter assessment of CSF phosphorylated tau for the prediction of conversion of MCI［J］．Neurology，2007，69：2 205－2 212．

［4］Fulga TA，Elson－Schwab I，Khurana V，et al．Abnormal bundling and accumulation of F－actin mediates tau－induced neuronal degeneration in vivo．Nat Cell Biol，2007，9：139－148．

［5］Thises E，Mandelkow EM．Missorting of tau in neurons causes degeneration of synapses that can be rescued by the kinase MARK2／Par－1［J］．J Neurosci，2007，27：2 896－2 907．