彭新 關(guān)兵 徐英 徐麗 李霞 張俊中 于愛民

·調(diào)查研究·

揚州市278例非綜合征性耳聾患者常見耳聾基因突變檢測結(jié)果分析△

彭新 關(guān)兵 徐英 徐麗 李霞 張俊中 于愛民

目的調(diào)查揚州地區(qū)非綜合征性耳聾（NSHI）患者分子流行病學(xué)特征，了解耳聾的分子病因。方法所選對象為江蘇省揚州市中、重度NSHI患者，共278例。利用耳聾基因芯片診斷試劑盒和直接測序2種方法篩查4個國人中常見的耳聾相關(guān)基因中的9個熱點突變，包括GJB2（35delG、176del16、235delC、299del AT），GJB3（538C＞T），SLC26A4（IVS7-2A＞G、2168A＞G）和線粒體DNA 12S rRNA（A1555G及1494C＞T）突變。結(jié)果在278例耳聾患者中，2種方法共檢出145例攜帶致聾突變（突變比率達到52.2％）。GJB2突變患者人數(shù)88例，其中純合突變51例（18.3％）、單雜合突變25例（9.0％）、復(fù)合雜合突變12例（4.3％）。SLC26A4純合突變14例（5.0％）、單雜合突變26例（9.4％）、復(fù)合雜合13例（4.7％）。235delC純合突變/SLC26A4 IVS7-2A＞G雜合突變1例（0.4％），235delC純合突變/SLC26A4 IVS7-2A＞G雜合突變1例（0.4％），線粒體DNA12SrRNA A1555G突變2例（0.7％）；陰性133例（47.8％）。結(jié)論揚州地區(qū)耳聾患者GJB2突變高于全國的遺傳性耳聾平均發(fā)生率。應(yīng)用耳聾基因診斷技術(shù)可以在耳聾患者病因調(diào)查中進行快速診斷篩查，值得推廣應(yīng)用。（中國眼耳鼻喉科雜志，2013，13：254-257）

耳聾基因； GJB2； SLC26A4； 線粒體突變； 非綜合征性耳聾

在我國每年患各種出生缺陷和先天殘疾的80萬～120萬名新生兒中，聽力殘疾是最常見的，也是最嚴(yán)重的。2006年第2次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，我國有聽力障礙患者多達2 780萬人，占全國8 296萬殘疾人的33.5％，列各類殘疾之首；造成聽力障礙的原因是多方面的，大致可以分為遺傳因素和環(huán)境因素兩大類，遺傳性耳聾約占50％；資料還顯示，在新生兒中，聽力損害的發(fā)生率0.05％，67.7％為遺傳缺陷所致［1］。世界第1個被克隆和鑒定遺傳性耳聾基因縫隙連接蛋白（gap junctionβ2，GJB2）由于其突變頻率的高發(fā)性，一直為研究熱點。在國內(nèi)，最常見的突變是235del C；大前庭導(dǎo)水管綜合征（large vestibular aqueduct syndrome，LVAS）相關(guān)基因SLC26A4為國人次要致病基因［2］。此外，氨基糖苷類藥物是線粒體A1555G突變的攜帶者高危因素。本課題對揚州市278例患者進行了GJB2、SLC26A4、線粒體DNA12S rRNA（1555A＞G）和GJB3突變篩查。

1 資料與方法

1.1 研究對象 特殊教育學(xué)校及門診患者共計307例受檢人群，通過介紹聾病基因篩查的意義及目的，讓受試者有初步了解，然后當(dāng)場發(fā)放“耳聾疾病調(diào)查問卷”。調(diào)查表內(nèi)容包括：目標(biāo)人群基本信息、耳聾史、家族史、耳聾前傳染病、耳毒性藥物應(yīng)用史、頭部外傷史等。并有專門培訓(xùn)醫(yī)師填寫“耳聾疾病病史模板”。同時填寫知情同意書（未滿18周歲者由家長或監(jiān)護人簽署）。入選標(biāo)準(zhǔn)：耳聾患者全部接受純音測聽和聲導(dǎo)抗檢查，檢查后發(fā)現(xiàn)278例患者為中、重度耳聾，極重度耳聾；其中聾校學(xué)生149例、門診患者129例；年齡4個月～56歲；男性142例、女性136例。排除標(biāo)準(zhǔn)：與國外種族聯(lián)姻家族史者；外耳、中耳畸形者；伴全身疾病者；智力障礙者；綜合征性耳聾（SHI）患者。經(jīng)問卷調(diào)查及體格檢查全部患者為非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI）。

1.2 DNA提取方法 用含枸櫞酸鈉抗凝劑（EDTA）的真空采血管采集受檢者3～5 mL外周靜脈血，應(yīng)用DNA試劑盒（QIAGEN公司），用BECKMAN DU800紫外分光光度計進行定量和純度檢測。取部分基因組DNA稀釋至200 ng/μL，剩余置-80℃保存。

1.3 基因芯片檢測 測試4個國人中常見的耳聾相關(guān)基因中的9個熱點突變，包括GJB2（35delG、176del16、235delC、299delAT），GJB3（538C＞T），SLC26A4（IVS7-2A＞G、2168A＞G）和線粒體DNA 12S rRNA（A1555G，1494 C＞T）。

檢測原理：針對不同突變位點設(shè)計2個帶不同標(biāo)簽的上游探針和1個下游帶Cv3熒光標(biāo)記的公共引物。先在液相中進行多重等位基因特異性引物延伸聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），其擴增產(chǎn)物在帶上一段標(biāo)簽序列（tag sequence）的同時，被單色熒光所標(biāo)記。將產(chǎn)物變性后，與固定有標(biāo)簽互補寡核苷酸序列的芯片雜交。通過激光掃描檢測出突變位點［3］。

檢測儀器及試劑：PCR儀（E-CY-CLER 96，北京博奧生物）、恒溫水浴箱、HZQ-C空氣浴振蕩器、熒光標(biāo)記引物以及晶芯微陣列芯片掃描儀及相應(yīng)軟件系統(tǒng)、質(zhì)控探針和DNA芯片、雜交盒及雜交試劑。

1.4 直接測序方法 參照文獻［4］報道的實驗方法，采用直接測序的方法檢測GJB2、SLC26A4 IVS7-2 A＞G 2168A＞G 2個位點和線粒體DNA 12S rRNA突變。用測序方法隨機驗證芯片方法所檢測出陽性樣本，發(fā)現(xiàn)符合率達100％。

2 結(jié)果

2.1 GJB2突變檢測結(jié)果 在本次調(diào)查的278例受試者中，用2種檢測方法發(fā)現(xiàn)攜帶GJB2致病突變總計88例，突變率31.7％（88/278），包括235delC純合突變44例（15.8％）、235delC單雜合突變17例（6.1％）、235delC和299delAT復(fù)合雜合突變9例（3.2％）、299delAT純合突變5例（1.8％）、299delAT單雜合突變3例（1.1％）。176del16純合突變2例（0.7％）、176del16雜合突變5例（1.8％）、176del16/235delC復(fù)合雜合突變3例（1.1％）。

2.2 SLC26A4突變檢測結(jié)果 在本次調(diào)查中，只檢測SLC26A4突變中最常見的2種突變位點，即SLC26A4 IVS7-2A＞G和2168A＞G，其中SLC26A4 IVS7-2A＞G純合突變9例（3.2％）、SLC26A4 IVS7-2A＞G雜合突變18例（6.5％）、SLC26A4 2168A＞G純合突變5例（1.8％）、SLC26A4 2168A＞G雜合突變8例（2.9％）、IVS7-2A＞G和2168A＞G復(fù)合雜合突變13例（4.7％）。對其中的確診患者行顳骨高分辨率CT檢查證實為LVAS。

2.3 線粒體DNA12SrRNA A1555G突變 278例樣本中有2例A1555G突變陽性，占0.7％。

2.4 多個基因突變患者 實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)1個有多個基因突變患者家庭，總共4個檢測對象。其中母親突變類型為235delC純合突變、父親突變類型為235delC雜合突變/SLC26A4 IVS7-2A＞G；第1胎為先證者，突變類型為235delC純合突變，第2胎突變類型為235delC雜合突變SLC26A4 IVS7-2A＞G雜合突變。對其家庭其余3個成員聽力檢測為中、重度耳聾，家庭4個成員進行顳骨CT檢查，均未發(fā)現(xiàn)前庭導(dǎo)水管異常。

未檢測出GJB3、1494 C＞T突變患者。

3 討論

耳聾是一種臨床常見病，新生兒耳聾的發(fā)病率為0.1％，出生時或3歲前出現(xiàn)聽力喪失稱為語前聾。造成耳聾的原因很多，50％以上兒童期耳聾為遺傳性聾，發(fā)病率為1/800～1/1 000［5］。這類患者除耳聾外不伴其他癥狀，稱為NSHI。目前有400多種綜合征性疾病伴耳聾或聽力減退，但是80％患者多為NSHI［6］，由于耳聾具有很強的遺傳異質(zhì)性和表型模糊，使得耳聾的遺傳機制比較復(fù)雜。在臨床上，由于感音性聾治療目前尚無有效辦法，只有從分子診斷水平做出分析，提早進行干預(yù)，才能有效降低發(fā)病率。下面就常見突變位點進行闡述。

GJB2（Cx26）是組成縫隙連接蛋白家族的一員，定位在13q11-q12，編碼連接蛋白26，有2個外顯子，是相鄰細胞間的特殊通道，第二信使和代謝小分子物質(zhì)的重要通道，在信息傳遞和物質(zhì)交換中起著重要的作用。Kikuchi等［7］利用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)GJB2基因在哺乳動物耳蝸高表達，并認(rèn)為縫隙連接在毛細胞受到外界刺激后鉀離子回流到內(nèi)淋巴的過程中有重要作用。它可以引起NSHI和SHI。目前發(fā)現(xiàn)有220多個突變位點，且在SHI患者中比例為10％～50％［1，8］。有文獻［9-10］報道，在日本235delC是主要突變形式，在所有GJB2突變中的比例高達73％。流行病學(xué)顯示，在中國及日本，GJB2最常見的4個突變位點為：235delC、35delG、176del16及299delAT；占GJB2突變的80％。Dai等［11-12］對中國18個省份聾校的1 680例NSHI病例GJB2基因235delC突變的篩查中，發(fā)現(xiàn)該突變檢出率為18.16％，陶崢等［13］的研究結(jié)果顯示，上海及周邊地區(qū)235delC為熱點突變。我們的實驗檢測出GJB2突變31.7％（88/278），其中檢查出雙等位基因總突變率患者占23.4％（65/278），均高于目前報道平均水平。產(chǎn)生原因可能是：①揚州及周邊地區(qū)GJB2致病率較高；②與檢測策略有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，檢測完致病突變患者后，對大多數(shù)患者直系家屬進行檢測，導(dǎo)致檢出率較高。GJB2導(dǎo)致的耳聾多數(shù)為是語前聾，呈非進行性，為重度及極重度。研究表明，大多數(shù)患者聽神經(jīng)是正常的，這些患者可以借助人工耳蝸植入的方法重建部分聽力，可以取得較好的聽力改善。所以，當(dāng)確診為GJB2突變患者，要把更多精力放在早期聽力干預(yù)和基因篩查從而進行產(chǎn)前診斷，評估風(fēng)險系數(shù)預(yù)測，指導(dǎo)患者家族內(nèi)成員的婚育，避免再次生育出此類遺傳性耳聾患兒。因此，實驗結(jié)果提示，在接下來的預(yù)防措施中，應(yīng)當(dāng)結(jié)合本地區(qū)的特點，以降低GJB2致聾率為主要工作任務(wù)。

LVAS屬于常染色體隱性遺傳病，先證者的父母為無臨床癥狀的突變攜帶者，患者常攜帶雙等位基因突變。且患者中有男性也有女性。在兒童和青少年感音神經(jīng)性聾中占1％～12％［14-15］。國外多項研究證實，SLC26A4基因突變與Pendred綜合征（前庭導(dǎo)水管擴大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫）和單純前庭導(dǎo)水管擴大和（或）內(nèi)耳畸形有密切關(guān)系，但是熱點突變存在著明顯的地域和種族差異。左路杰等［16］報道，SLC26A4基因突變位點超過150多個，其中大多數(shù)為錯義突變。在我國，袁永一等［4］在國內(nèi)外首次對大規(guī)模重度、極重度耳聾人群進行了基于SLC26A4基因熱點突變的該基因全序列分析，2 352例來自全國多個地區(qū)的耳聾患者中271例攜帶SLC26A4基因ⅣS7-2A＞G突變，ⅣS7-2A＞G突變總檢出率達到11.52％（27l/2 352）。通過基因篩查初步了解揚州地區(qū)SLC26A4基因相關(guān)前庭導(dǎo)水管擴大的發(fā)病情況超過10％。本文通過對揚州地區(qū)篩查發(fā)現(xiàn)，SLC26A4基因最常見的突變方式是IVS7-2A＞G。SLC26A4攜帶雙等位基因突變患者達到9.7％（27/278），這與中國LVAS耳聾人群的文獻報道基本相符合。我們對雙等位基因突變患者進行顳骨高分辨率CT掃描發(fā)現(xiàn)，均證實為LVAS患者。同樣對剩余單雜合突變患者經(jīng)行CT發(fā)現(xiàn)4例為LVAS患者，出現(xiàn)其原因為存在另外一個少見外顯子突變。需要進一步實驗證實。

氨基糖苷類藥物誘發(fā)的耳聾具有一些共同特征，即雙側(cè)對稱性以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性聾，患者通常有明確的氨基糖苷類藥物應(yīng)用史。目前大量研究已證實mtDNA突變與此類耳聾密切相關(guān)，部分患者對氨基糖苷類藥物有易感性，即極小的量就可以造成聽力損失。mtDNA 12S rRNA是突變熱點，本實驗中發(fā)現(xiàn)突變位點以第1555位A＞G均質(zhì)性點突變。且在本實驗病史采集中發(fā)現(xiàn)，19位患者提供明確藥物耳毒性藥物使用史，但檢查結(jié)果只發(fā)現(xiàn)2例攜帶該突變，未檢測出1494 C＞T突變?？紤]原因主要為由于耳毒性藥物使用較廣泛，患者簡單認(rèn)為耳聾和使用藥物相關(guān)。對于檢測處該突變的患者家族，最直接、有效的辦法是終身禁用耳毒性藥物。

綜上所述，通過對278例患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)揚州地區(qū)GJB2致聾高于國內(nèi)其他報道水平，對于大多數(shù)患者可以從分子學(xué)進行診斷，能夠體現(xiàn)出揚州及周邊地區(qū)遺傳性耳聾流行病學(xué)自身特點，從而為降低發(fā)病率、優(yōu)生優(yōu)育提供理論基礎(chǔ)。基因芯片能夠快速對常見突變進行診斷，值得在基層醫(yī)院推廣。直接測序技術(shù)能夠?qū)φ麠l基因進行測序工作。兩者聯(lián)合檢測，能夠提供更多遺傳信息。

［1］Hilgert N，Smith RJH，Van Camp G.Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment：which one should be analyzed in DNAdiagnostics？［J］.Mutat Res，2009，681（2/3）：189-196.

［2］劉學(xué)忠，歐陽小梅，Denise Yan，等.中國人群遺傳性耳聾研究進展［J］.中華耳科學(xué)雜志，2006，4（2）：81-89.

［3］LiCX，Pan Q，Guo YG，etal.construction of amultiplx allele-spcific PCR-based uliversal array（ASPUA）and its application to hearing loss screening［J］.Hum Mutat，2008，29（2）：306-314.

［4］袁永一，黃莎莎，王國建，等.27個省市聾校學(xué)生基于SLC26A4基因IVS7-2 A＞G突變的全序列分析［J］.中華耳科學(xué)雜志，2011，9（1）：17-23.

［5］Steel KP.Science，medicine and the future：new interventions in hearing impairment［J］.BMJ，2000，320（7235）：622-625.

［6］Posukh O，Pallares-Ruiz N，Tadinova V，etal.Firstmolecular screening of deafness in the Altai Republic population［J］.BMC Med Genet，2005，6（1）：12.

［7］Kikuchi T，Kimura RS，Paul DL，et al.Gap junction systems in the mammalian cochlea［J］.Brain Res Brain Res Rev，2000，32（1）：163-166.

［8］Yuan Y，Yu F，Wang G，et al.Prevalence of the GJB2 IVS1+1G＞A mutation in Chinese hearing loss patients with monoallelic pathogenic mutation in the coding region of GJB2［J］.JTranslMed，2010，8（1）：127.

［9］Ito T，Noguchi Y，Yashima T，et al.Hereditary hearing loss and deafness genes in Japan［J］.JMed Dent Sci，2010，57（1）：1-10.

［10］Kudo T，Ikeda K，Kure S，etal.Novelmutations in the connexin 26 gene（CJB2）responsible for childhood deafness in the Japanese population［J］.Am JMod Cenet，2000，90（2）：141-145.

［11］Dai P，Yu F，Han B，et al.GJB2 mutation spectrum in 2063 Chinese patientswith nonsyndromic hearing impairment［J］.JTransl Med，2009，7（26）：1-12.

［12］戴樸，劉新，于飛，等.18個省市聾校學(xué)生非綜合征性聾病分子流行病學(xué)研究（I）——GJB2 235delC和線粒體DNA 12S rRNA A1555G突變篩查報告［J］.中華耳科學(xué)雜志，2006，4（1）：l-5.

［13］陶崢，馬衍，歐陽治國，等.205例先天性非綜合征型聾患兒GJB2基因突變分析［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2010，18（1），67-68.

［14］Gtiffith AJ，Arts A，Downs C，et al.Familial large vestibular aqueduct syndrome［J］.Laryngoscope，1996，108（8）：960-965.

［15］Mafong DD，Shin EJ，Lalwani AK.Use of laboratory evaluation andradiologic imaging in the diagnostic evaluation of children with sensofinenral hearing lose［J］.Laryngoscope，2002，112（1）：1-7.

［16］左路杰，張勛，袁永一.Pendred綜合征臨床特點及病因研究進展［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2011，19（6）：576-578.

（本文編輯 楊美琴）

·學(xué)術(shù)動態(tài)·

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院“全國白內(nèi)障、眼表疾病高級研修班和名醫(yī)論壇”通知

茲定于2013年11月7～10日在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舉辦“全國白內(nèi)障、眼表疾病高級研修班和名醫(yī)論壇”，包含兩項繼續(xù)教育項目（項目代碼20130702052，Ⅰ類學(xué)分10分；項目代碼20130702204，Ⅰ類學(xué)分10分）。學(xué)習(xí)期滿并合格者將授予國家級繼續(xù)教育Ⅰ類學(xué)分。

“晶狀體疾病的診治及進展”高級研修班和名醫(yī)論壇：由國內(nèi)著名專家盧奕教授、羅怡教授及特邀的國內(nèi)外其他知名專家等擔(dān)任主講和手術(shù)示范。授課內(nèi)容包括白內(nèi)障手術(shù)現(xiàn)狀、挑戰(zhàn)及IOL概論（包括各種高端IOL的應(yīng)用）、白內(nèi)障手術(shù)前后的輔助檢查、角膜屈光手術(shù)后IOL測量（RK、PRK、LASIK和LASEK術(shù)后IOL的計算）、個性化IOL的選擇、白內(nèi)障手術(shù)散光的控制、微創(chuàng)白內(nèi)障手術(shù)、復(fù)雜白內(nèi)障的超乳手術(shù)分享及病例討論、晶狀體脫位的處理、虹膜缺損時白內(nèi)障手術(shù)、先天性白內(nèi)障診斷和治療、二期IOL植入、眼內(nèi)炎的預(yù)防和治療、IOL脫位處理等。復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院是衛(wèi)生部和上海市眼科住院醫(yī)師培訓(xùn)基地，并擁有專門的白內(nèi)障手術(shù)模擬訓(xùn)練室，擁有8臺Infiniti超乳設(shè)備、8臺Leica顯微鏡手術(shù)操作系統(tǒng)和8個工作臺以及多媒體教學(xué)系統(tǒng)，讓學(xué)員體驗真實的動物實驗超聲乳化感覺。

“眼表疾病診治及進展”學(xué)習(xí)班：由國內(nèi)著名專家徐建江教授、張朝然教授和龔嵐教授等擔(dān)任主講。授課內(nèi)容包括：①各類常見眼表疾病，諸如感染性角膜病變、免疫性角膜病變、干眼、角膜營養(yǎng)不良以及過敏性結(jié)膜炎等的傳統(tǒng)治療及診療進展；②主要眼表手術(shù)及進展，除對穿透性角膜移植、板層角膜移植等常規(guī)手術(shù)進行講解，還將重點對近年來國際上出現(xiàn)的深部前板層和后彈力層撕除的角膜內(nèi)皮移植等新型手術(shù)方式進行演示和講解；③新型眼前節(jié)檢查設(shè)備在眼表疾病診治中的應(yīng)用，主要包括角膜共聚焦顯微鏡和眼前節(jié)OCT的應(yīng)用和結(jié)果分析；④疑難和典型病例分享，通過實際病例分析，進一步加深學(xué)員對眼表疾病知識的掌握。

本次學(xué)習(xí)班學(xué)費1000元，資料費150元（含1本講義和1張光盤）。聯(lián)系人：陸萍，電話：021-64377134-706；021-64318258。更詳細的內(nèi)容及報名回執(zhí)表可從復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院網(wǎng)站（http：//www.fdeent.org/）下載。竭誠歡迎廣大眼科醫(yī)師前來學(xué)習(xí)交流。

陸萍

Mutation of gene in nonsyndrom ic hearing impairment patients：analysis of 278 cases in Yangzhou area

PENG Xin，GUAN Bing，XU Ying，XU Li，LIXia，ZHANG Jun-zhong，YU Ai-min.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Clinical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，China

GUAN Bing，Email：aliceguan0685＠sina.com

Objective To survey themolecular epidemiological basis of non-syndromic hearing loss in Yangzhou area.Methods Two hundred and seventy-eight patients with severe non-syndromic deafness in Yangzhou city were included in the study.Deafness gene chip diagnostic kit for screening and direct sequencing were used for screening the nine hot spotsmutations in four common deafness-related genes of Chinese people.These nine hot spots genemutations included GJB2（35delG，176del16，235delC and 299del AT），GJB3（538C＞T），SLC26A4（IVS7-2A＞G，2168A＞G）and mtDNA 12S rRNA（A1555G，1494C＞T）.Results In 278 patients，there were 145 cases of deafness caused by mutation（carrying themutation ratio reached 52.2％）.The GJB2mutationswere found in 88 cases，including51 cases of homozygousmutations（18.3％），25 cases（9％）of single heterozygousmutations，and 12 patients（4.3％）of compound heterozygousmutations.SLC26A4 homozygous mutations were found in 14 cases（5％），including single heterozygousmutations in 26 cases（9.4％），compound heterozygosity in 13 cases（4.7％）.235delC homozygous mutation/SLC26A4 IVS7-2A＞G heterozygous mutation was found in 1 case（0.4％），DNA12SrRNA mitochondrial A1555Gmutation was found in 2 patients（0.7％）.And 133 cases（47.8％）showed negative.Conclusions The deaf patients in Yangzhou were found to have a higher incidence of genetic deafness in GJB2.It was worth applying the deafness gene diagnostic techniques into rapid diagnostic screening of the cause of deafness.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：254-257）

Deafness gene；GJB2 gene；SLC26A4 gene；mitochondrialmutations；non-syndromic deafness

2012-09-26）

揚州市社會發(fā)展項目（YZ2009047）；江蘇省科技支撐計劃（SBE201270809）

揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科 揚州 225001

關(guān)兵（Email：aliceguan0685＠sina.com）