沈智勇（綜述） 申 鍔 胡 兵（審校）

低頻超聲通常指頻率20 kHz～1 MHz的超聲波，具有波長較長、聲能吸收少、容易穿透組織、對(duì)正常組織損傷小等特點(diǎn)[1]。低頻超聲是目前超聲研究的熱點(diǎn)之一，低頻超聲聯(lián)合造影劑在腫瘤治療方面具有重要價(jià)值，其生物學(xué)效應(yīng)包括機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)及化學(xué)效應(yīng)等，其中最重要的是空化效應(yīng)[2]。空化是在一定的聲場(chǎng)條件下，液體中的微小氣泡經(jīng)歷脈動(dòng)、膨脹、收縮、崩潰破滅的現(xiàn)象[2]，可以引發(fā)一系列物理、化學(xué)效應(yīng)——破壞生物細(xì)胞膜，增加細(xì)胞通透性、加快化學(xué)反應(yīng)速度，產(chǎn)聲發(fā)光等。本文主要就空化效應(yīng)的原理、微觀研究、聲孔效應(yīng)及抗腫瘤治療等方面作一綜述。

1 空化效應(yīng)的物理機(jī)制

空化與聲場(chǎng)聲壓、液體及其中的微泡等關(guān)系密切。微泡的初始半徑在空化泡生長和潰滅過程中起重要作用[3]。微泡半徑小于共振半徑可以增強(qiáng)聲空化效應(yīng)，單純?cè)黾勇晥?chǎng)頻率不一定能增強(qiáng)空化效果[4]。與聲波共振氣泡比較，大空化泡難以潰滅，為穩(wěn)態(tài)空化泡；小空化泡易潰滅，為瞬態(tài)空化泡[5]?？栈菰谂蛎浐蛪嚎s過程中，無論半徑大小，泡外均可形成一個(gè)較小的低壓球殼[6]。單個(gè)空化泡在剛性壁面（“硬”邊界）附近潰滅，在壁面形成較大的壓強(qiáng)差[7]。以空化泡球心正對(duì)的壁面上的點(diǎn)為圓心形成一個(gè)較小的低壓環(huán)，該低壓環(huán)形成沖擊波[8]。微泡潰滅時(shí)，在剛性壁面形成的低壓環(huán)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膨脹時(shí)在剛性壁面形成的低壓環(huán)，因此空化效應(yīng)應(yīng)該出現(xiàn)在空化泡崩潰時(shí)。溫度越低[9]、頻率越低、聲壓越大，空化泡運(yùn)動(dòng)越劇烈；微泡崩潰瞬間，泡內(nèi)最高溫度隨氣體比熱比的增加呈線性增大，最大壓力隨氣體比熱比的增大而減小[10]。

隨著液體黏度增加、表面張力增大、微泡擴(kuò)張受限，微泡膨脹程度及泡內(nèi)溫度升高程度均降低[11]。降低環(huán)境溫度，選用單原子氣體及提高聲場(chǎng)聲壓等均可以增強(qiáng)空化效應(yīng)[6,12]。由于表面張力的作用，微氣泡的形狀幾乎均呈球形，外界對(duì)氣泡做功和氣泡體積變化呈線性關(guān)系，與氣泡半徑無線性關(guān)系[13]。微泡運(yùn)動(dòng)具有明顯的非線性特征，表現(xiàn)為緩慢地膨脹和急劇地壓縮，在10 Pa量級(jí)超聲的驅(qū)動(dòng)下，氣泡的最大半徑與最小半徑之比可以達(dá)到10數(shù)量級(jí)，體積壓縮比為1000數(shù)量級(jí)[14]，因此超聲空化泡具有很高的聚能能力。在壓縮至最小半徑前后，空化泡內(nèi)部有罕見的高溫高壓，最高溫度達(dá)數(shù)千開氏度、壓力達(dá)數(shù)千帕[14]。低聲壓時(shí)，微泡振動(dòng)的振幅在很大程度上取決于微泡直徑，在共振頻率振動(dòng)時(shí)微泡振幅最大。如1 MHz超聲，水中游離微泡的振幅大約在7 μm[15]。通?？栈F(xiàn)象在低頻時(shí)更明顯。大泡沫或空氣-水界面僅作為超聲波的反射平面。增加氣泡數(shù)量可以增加空化效果；作為空化活動(dòng)的一部分，空化泡崩潰時(shí)，產(chǎn)熱發(fā)光，產(chǎn)生自由基、沖擊波，可以引起二次生物效應(yīng)。

2 空化效應(yīng)的觀研究

高速顯微攝影觀察微泡在離體大鼠腸系膜微血管中的活動(dòng)條件為：一個(gè)超聲脈沖，頻率1 MHz、峰值負(fù)壓11 MPa。微氣泡振蕩，在極短時(shí)間（μs）內(nèi)膨脹、內(nèi)陷、最后破裂，附近微血管受微泡活動(dòng)的影響也發(fā)生一系列改變：在聲輻射壓作用下，微泡與血管壁接觸，微泡膨脹，血管擴(kuò)張；微泡崩潰，血管收縮；且收縮幅度明顯大于初始的擴(kuò)張幅度[16]。在11 MPa 的聲壓作用下，微泡膨脹，附近直徑17 μm的微血管受到影響，擴(kuò)張到1.7倍時(shí)，微泡破裂，血管收縮，最終至初始直徑的0.4倍，微泡崩潰產(chǎn)生的子微泡重復(fù)上述現(xiàn)象，微血管擴(kuò)張、收縮，最終可能破裂[16]。然而，若微血管直徑過大，微泡膨脹后，與血管壁無接觸，則無上述現(xiàn)象。Brujan等[17]認(rèn)為，大量微泡膨脹時(shí)，血管壁隨之向外擴(kuò)張，血管壁彈性界面存儲(chǔ)了一定的能量；當(dāng)微泡在聲壓作用下內(nèi)陷破裂時(shí)，血管壁彈性界面隨之向內(nèi)收縮；血管壁回縮產(chǎn)生短暫的壓力梯度，壓力梯度垂直于血管壁，當(dāng)壓力梯度足夠大時(shí)，則產(chǎn)生微射流，其作用于血管內(nèi)的微泡，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

Chen等[18]使用高速顯微攝影研究離體大鼠腸系膜微血管中單個(gè)微氣泡運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化。研究條件是一個(gè)超聲脈沖波，2 μs，頻率1 MHz，負(fù)壓峰值為0.8～4 MPa，微血管直徑為10～80 μm。微泡灌注進(jìn)入鼠腸系膜組織血管，外加超聲輻照，微泡在超聲激勵(lì)下振蕩，發(fā)生膨脹、塌陷，同時(shí)腸系膜血管壁也相應(yīng)發(fā)生變形。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下，血管壁內(nèi)陷程度大于開始時(shí)的血管膨脹程度，尖銳、缺口狀內(nèi)陷形狀表明血管壁受到較大機(jī)械應(yīng)力，微泡不對(duì)稱塌陷，形成液體射流，可穿透微泡；血管壁在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)生上述改變，其內(nèi)陷時(shí)間為1.5～2.5 μs，速度可達(dá)9 m/s。微泡破裂后消失，超聲波脈沖逐漸遠(yuǎn)去，血管壁達(dá)到最大的內(nèi)陷程度后，在微秒時(shí)間內(nèi)血管壁又回到最初的形狀。聲壓越大，微泡的激勵(lì)振蕩越大：當(dāng)聲壓從52 kPa增加13倍達(dá)680 kPa時(shí)，微泡最大半徑增加2.5倍，最大剪切力增加15.7倍[19]。血管內(nèi)徑與微泡直徑之比越低，剪切力越大；微泡直徑越接近血管直徑，對(duì)血管壁作用力越大；而當(dāng)血管直徑遠(yuǎn)大于微泡直徑，微泡遠(yuǎn)離血管中心時(shí)，激勵(lì)振蕩，形成蘑菇形狀，只能對(duì)附近血管壁產(chǎn)生作用[19]。

3 空化效應(yīng)的細(xì)胞作用

低頻超聲輻照細(xì)胞的空化效應(yīng)主要利用非熱機(jī)制。非熱機(jī)制出現(xiàn)在生物效應(yīng)的任何過程，無明顯熱效應(yīng)（＜生理溫度 ±1°）[20]。

微泡空化可以誘發(fā)單細(xì)胞死亡或瞬態(tài)膜通透性增加（聲孔效應(yīng)），攝取DNA及大分子物質(zhì)增多[21]。聲孔效應(yīng)最初是在20 kHz超聲的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)的，20 kHz超聲輻照哺乳動(dòng)物細(xì)胞，40%的細(xì)胞恢復(fù)正常，10%的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)熒光右旋葡聚糖分子[22]。此后研究發(fā)現(xiàn)鼠骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞經(jīng)超聲輻照后，熒光葡聚糖吸收率也明顯增加[23]。

Johannes等[24]研究顯示，培養(yǎng)液中存在內(nèi)切酶，20 kHz超聲作用于細(xì)胞后，20%的細(xì)胞出現(xiàn)染色體畸變；無超聲作用的細(xì)胞內(nèi)部幾乎無染色體畸變，表明該酶通過聲孔效應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞。此外，低頻超聲用于DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如超聲輻照鼠成纖維細(xì)胞，可以增加細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。低頻超聲可以利用空化效應(yīng)增加細(xì)胞通透性，提高轉(zhuǎn)染率，通常需加入外源性空化核，如超聲造影劑。

4 空化效應(yīng)的體內(nèi)研究

基因載體與超聲造影劑混合后，經(jīng)靜脈注射，同時(shí)超聲輻照，結(jié)果造影劑破裂，產(chǎn)生空化效應(yīng)，局部毛細(xì)血管破裂，基因載體向血管外特異性組織或靶細(xì)胞靶向發(fā)送DNA，可以大大減少全身應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染的副作用[25]。

開發(fā)可以識(shí)別、黏附特異性組織的智能造影劑，不僅可以提高空間分辨率，而且可以提供一個(gè)可靶向發(fā)送遺傳物質(zhì)的類似的郵編地址[15]。低頻超聲可以引起脂肪減少、組織結(jié)構(gòu)改變及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。組織學(xué)改變包括脂肪結(jié)構(gòu)變化、膠原纖維破壞。掃描電鏡顯示，脂肪細(xì)胞損傷增多，三酰甘油、膽固醇增加，細(xì)胞凋亡，DNA碎片形成，procaspase-9下調(diào)，caspase-3活性增加[26]。低頻超聲（20～150 kHz）可以用于跨皮給藥，超聲空化作用可以導(dǎo)致皮膚角質(zhì)層缺損，滲透性增加，局部藥物分子吸收加速[27]。咖啡因是親水性藥物，Boucaud等[28]采用20 kHz，占空比10%，空間平均時(shí)間聲強(qiáng)（SATA）2.5 W/cm2的超聲輻照皮膚，結(jié)果顯示，咖啡因滲透人體皮膚增加3.73倍。采用連續(xù)波40 kHz，SATA強(qiáng)度0.44 W/cm2超聲輻照，裸鼠皮膚咖啡因通量增加13.81倍，未見局部皮溫升高；20 kHz超聲，占空比10%，SATA強(qiáng)度0.37 W/cm2，作用時(shí)間5 min，咖啡因吸收量幾乎增加4倍。超聲輻照同時(shí)給藥的效果優(yōu)于先超聲輻照后給藥的方式。聲空化不僅產(chǎn)生角質(zhì)層缺陷，同時(shí)形成繼發(fā)性二次微射流，進(jìn)一步加快通過這些缺陷部位的藥物量。角質(zhì)層具有彈性，超聲停止后，一些空化激發(fā)形成的微孔也關(guān)閉[29]。

低頻超聲輻照腫瘤可以破壞腫瘤脆弱的血管[30-32]。研究顯示，C3HV/HeN小鼠皮下接種K1735（22）黑色素瘤，尾靜脈團(tuán)注微泡0.1 ml超聲造影劑Optison，采用1 MHz、2.28 W/cm2連續(xù)波超聲輻照腫瘤，作用時(shí)間1～3 min[30]。超聲造影表明，治療前腫瘤內(nèi)部存在血流灌注，治療3 min后，腫瘤灌注缺損區(qū)面積達(dá)82%（P＜0.001）；線性回歸分析結(jié)果顯示，超聲治療1 min，腫瘤血管減少25%，抗血管作用可持續(xù)24 h。腫瘤治療1周后，與對(duì)照組比較，治療組腫瘤生長明顯受抑[30]。超聲輻照區(qū)腫瘤血管充血、血栓形成，血管壁破壞、腫瘤細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞破壞、死亡可能繼發(fā)于腫瘤缺血。治療后瘤區(qū)新生血管破壞，但瘤周正常組織的血管未受影響，正常組織的血管神經(jīng)也未受破壞[30]。Bunte等[31]研究發(fā)現(xiàn)，低頻超聲輻照小鼠皮下腫瘤，組織學(xué)表現(xiàn)顯示，急性期腫瘤毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，細(xì)胞間質(zhì)水腫，組織液增多；慢性期瘤細(xì)胞出現(xiàn)液化性壞死[31]。雙頻超聲聯(lián)合也可以用于治療腫瘤[32]。1 MHz和150 kHz超聲同時(shí)應(yīng)用，輻照BALB/c鼠乳腺癌腫瘤，發(fā)現(xiàn)雙頻、低強(qiáng)超聲（空間峰值時(shí)間平均聲強(qiáng)ISPTA＜6 W/cm2）化學(xué)反應(yīng)速度大大加快，腫瘤生長明顯延緩[32]?？傊?，靜脈注射微泡造影劑，然后超聲輻照，可以暫時(shí)減少腫瘤血流量；反復(fù)輻照，腫瘤血供受抑制，生長延緩。中等強(qiáng)度的超聲聯(lián)合微泡即可以抑制腫瘤生長。

5 空化效應(yīng)的臨床應(yīng)用

張鳳春等[33]采用低頻（50 kHz）、低功率（0.5 W）超聲輻射微泡劑（CO2）治療17 例晚期實(shí)體瘤患者，部分緩解4例，疾病穩(wěn)定6例，進(jìn)展7例，1年總生存率為41.18%（7/17），2年總生存率為17.65%（3/17）。研究發(fā)現(xiàn)，CO2微泡劑小部分可以通過肺循環(huán)到達(dá)靶組織，提高局部組織的空化核含量，低功率超聲輻照微泡產(chǎn)生空化效應(yīng)，微血管壁、部分周圍組織破碎，激活內(nèi)源或外源性凝血，誘發(fā)毛細(xì)血管血栓，切斷作用區(qū)的血供，無微泡劑區(qū)則少有血栓形成，單純微泡劑組未經(jīng)超聲輻射者組織基本完好[33]。低頻超聲聯(lián)合微泡取得較好的臨床效果，患者生活質(zhì)量、遠(yuǎn)期生存率得到提高。少數(shù)患者的治療部位有針刺樣麻木感、刺痛或輕度充血，停止治療后自行緩解，未發(fā)生瘤外其他部位血栓、氣泡栓塞等不良反應(yīng)，提示低頻超聲輻射微泡治療腫瘤安全、有效[33]。

總之，低頻超聲的空化效應(yīng)可以增加細(xì)胞通透性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染；增加皮膚角質(zhì)層通透性，促進(jìn)藥物吸收；破壞腫瘤血管，減少腫瘤血供，抑制腫瘤生長，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

[1] Ueda H, Mutoh M, Seki T, et al. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull, 2009, 32(5): 916-920.

[2] Wollina U, Heinig B, Naumann G, et al. Effects of low-frequency ultrasound on microcirculation in venous leg ulcers. Indian J Dermatol, 2011, 56(2): 174-179.

[3] Silvano B, Karel V. Intensity of oscillation of spark-generated bubbles. J Sound Vib, 2010, 329(20): 4266-4278.

[4] Wu Junru, Nyborg WL. Ultrasound, cavitation bubbles and their interaction with cells. Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60(10): 1103-1116.

[5] Vogel A, Noack J, Hüttman G, et al. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B, 2005,81(8): 1015-1047.

[6] Shchukin DG, Skorb E, Belova V, et al. Ultrasonic cavitation at solid surfaces. Adv Mater, 2011, 23(17): 1922-1934.

[7] Prabowo F, Ohl CD. Surface oscillation and jetting from surface attached acoustic driven bubbles. Ultrason Sonochem, 2011, 18(1):431-435.

[8] Dabiri S, Sirignano W, Joseph D. A numerical study on the effects of cavitation on orifice flow. Physics of Fluids, 2010, 22(4):042102-042113.

[9] Rooze J, Rebrov EV, Schouten JC, et al. Dissolved gas and ultrasonic cavitation--a review. Ultrason Sonochem, 2013, 20(1):1-11.

[10] 李爭(zhēng)彩, 林書玉. 超聲空化影響因素的數(shù)值模擬研究. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) , 2008, 36(1): 38-42.

[11] Webb IR, Payne SJ, Coussios CC. The effect of temperature and viscoelasticity on cavitation dynamics during ultrasonic ablation. J Acoust Soc Am, 2011, 130(5): 3458-3466.

[12] 羅賢能, 趙良舉, 奉策強(qiáng). 等. 聲空化氣泡成長及破裂研究. 工程熱物理學(xué)報(bào), 2011, 32(1): 17-20.

[13] Gutvik CR, Brubakk AO. A dynamic two-phase model for vascular bubble formation during decompression of divers. IEEE Trans Biomed Eng, 2009, 56(3): 884-889.

[14] Huang W, Chen WZ, Gao XX, et al. Comparison between the single-bubble sonoluminescences in sulfuric acid and in water.Science in China Series G: Physics Mechanics and Astronomy,2009, 52(2): 184-188.

[15] Miller DL, Pislaru SV, Greenleaf JE. Sonoporation: mechanical DNA delivery by ultrasonic cavitation. Somat Cell Mol Genet,2002, 27(1-6): 115-134.

[16] Chen H, Brayman AA, Matula TJ. Microbubble dynamics in microvessels: observations of microvessel dilation, invagination and rupture. IEEE, 2008: 1163-1166.

[17] Brujan EA, Nahen K, Schmidt P, et al. Dynamics of laser-induced cavitation bubbles near an elastic boundary. J Fluid Mech, 2001,433: 251-282.

[18] Chen H, Kreider W, Brayman AA, et al. Blood vessel deformations on microsecond time scales by ultrasonic cavitation. Phys Rev Lett, 2011, 106(3): 034301.

[19] Hosseinkhah N, Hynynen K. A three-dimensional model of an ultrasound contrast agent gas bubble and its mechanical effects on microvessels. Phys Med Biol, 2012, 57(3): 785-808.

[20] Alexandrov BS, Rasmussen K?, Bishop AR, et al. Non-thermal effects of terahertz radiation on gene expression in mouse stem cells. Biomed Opt Express, 2011, 2(9): 2679-2689.

[21] Lemmon JC, Mcfarland RJ, Rybicka JM, et al. In vitro and in vivo transfection of primary phagocytes via microbubble-mediated intraphagosomal sonoporation. J Immunol Methods, 2011, 371(1-2): 152-158.

[22] Fechheimer M, Denny C, Murphy RF, et al. Measurement of cytoplasmic pH in Dictyostelium discoideum by using a new method for introducing macromolecules into living cells. Eur J Cell Biol, 1986, 40(2): 242-247.

[23] Hernot S, Klibanov AL. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60(10): 1153-1166.

[24] Johannes C, Obe G. Ultrasound permeabilizes CHO cells for the endonucleases Alul and benzon nuclease. Mutat Res, 1997, 374(2):245-251.

[25] Cavalieri F, Zhou M, Ashokkumar M. The design of multifunctional microbubbles for ultrasound image-guided cancer therapy. Curr Top Med Chem, 2010, 10(12): 1198-1210.

[26] Palumbo P, Cinque B, Miconi G, et al. Biological effects of low frequency high intensity ultrasound application on ex vivo human adipose tissue. Int J Immunopathol Pharmacol, 2011, 24(2): 411-422.

[27] Park EJ, Werner J, Smith NB. Ultrasound mediated transdermal insulin delivery in pigs using a lightweight transducer. Pharm Res,2007, 24(7): 1396-1401.

[28] Boucaud A, Montharu J, Machet L, et al. Clinical, histologic,and electron microscopy study of skin exposed to low-frequency ultrasound. Anat Rec, 2001, 264(1): 114-119.

[29] Yuan Y, Verma R. Measuring microelastic properties of stratum corneum. Colloids Surf B Biointerfaces, 2006, 48(1): 6-12.

[30] Wood AK, Ansaloni S, Ziemer LS, et al. The antivascular action of physiotherapy ultrasound on murine tumors. Ultrasound Med Biol,2005, 31(10): 1403-1410.

[31] Bunte RM, Ansaloni S, Sehgal CM, et al. Histopathological observations of the antivascular effects of physiotherapy ultrasound on a murine neoplasm. Ultrasound Med Biol, 2006, 32(3): 453-461.

[32] Barati AH, Mokhtari-Dizaji M, Mozdarani H, et al. Treatment of murine tumors using dual-frequency ultrasound in an experimental in vivo model. Ultrasound Med Biol, 2009, 35(5): 756-763.

[33] 張鳳春, 左麗, 王紅霞, 等. 低功率超聲空化治療腫瘤的臨床研究. 腫瘤, 2011, 31(2): 160-164.