葉紅偉 康品方 王洪巨 李正紅 關(guān)宿東 高 琴 (蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 33030)

乙醛脫氫酶2在法舒地爾心肌保護(hù)作用中的機(jī)制

葉紅偉1康品方2王洪巨2李正紅 關(guān)宿東 高 琴1(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

目的探討乙醛脫氫酶2(ALDH2)是否參與Rho激酶抑制劑法舒地爾的心肌保護(hù)作用，并分析其可能機(jī)制。方法采用離體大鼠心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支30 min模擬局部心肌缺血，松開結(jié)扎線恢復(fù)灌流120 min復(fù)制心肌缺血/再灌注(I/R)模型。實(shí)驗分4組:I/R組、法舒地爾組、ALDH2抑制劑氨基氰(CYA)組和法舒地爾+CYA(聯(lián)合組)組。連續(xù)記錄左心室動力學(xué)變化，再灌注期間收集冠脈流出液測定乳酸脫氫酶(LDH)含量;RT-PCR檢測ALDH2 mRNA表達(dá)以及Bcl-2/Bax比值的變化。結(jié)果與I/R組比，法舒地爾組明顯促進(jìn)了左室發(fā)展壓、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率、左心室做功的恢復(fù)，降低復(fù)灌期冠脈流出液中LDH的釋放，ALDH2 mRNA表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比值增高。ALDH2抑制劑CYA明顯減弱法舒地爾的作用，抑制了心室動力學(xué)指標(biāo)的恢復(fù)，LDH釋放增多，ALDH2 mRNA表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值降低。結(jié)論法舒地爾抑制Rho激酶信號通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激動ALDH2、抑制凋亡發(fā)生有關(guān)。

心臟;缺血/再灌注損傷;乙醛脫氫酶2;Rho激酶;法舒地爾;氨基氰

Rho/Rho激酶信號通路參與高血壓、心力衰竭、心肌梗死和動脈粥樣硬化(AS)等主要心血管疾病的發(fā)生。多數(shù)研究顯示抑制Rho激酶可以通過激活PI3K/Akt/eNOS途徑來保護(hù)心血管系統(tǒng)，提示心臟I/R損傷中的Rho激酶可能抑制RISK途徑〔1～3〕。乙醛脫氫酶2(ALDH2)是存在于線粒體內(nèi)的一種氧化乙醛的酶，已有研究表明ALDH2激動劑可以保護(hù)心肌，對抗I/R損傷〔4〕。抑制Rho激酶活性和激活A(yù)LDH2都可以發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但兩者是否存在關(guān)系，目前尚不清楚。本研究觀察Rho激酶抑制劑法舒地爾和ALDH2抑制劑氨基氰(CYA)對心臟功能的影響，探討ALDH2是否參與法舒地爾的心肌保護(hù)作用，為臨床I/R損傷的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物和材料 健康雄性SD大鼠體重200～250 g，清潔級，32只，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供。川威注射液(鹽酸法舒地爾注射液)購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司;CYA購自 Sigma公司。改良 Krebs-Henseleit(K-H)液成分:NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，pH 7.3～7.4。Trizol試劑購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自Fermentas公司;引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，所用ALDH2引物:上游5'-GTG TTCGGA GACGTCAAA GA-3'，下游 5'-GCA GAG CTT GGG ACA GGT AA-3'，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長187 bp;Bax引物:上游5'-GGA TCGAGCAGAGAGGATGG-3'，下游5'-TGG TGA GTG AGG CAG TGA GG-3'，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長464 bp;Bcl-2引物:上游5'-AG CCT GAG AGC AAC CGA AC-3'，下游 5'-CGG TAG CGA CGA GAG AAG-3'，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長163 bp;以β-actin為內(nèi)參照，引物上游5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA GGA C-3'，下游 5'-GCTCAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3'，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長630 bp。

1.2 大鼠心肌I/R損傷模型復(fù)制及分組 大鼠置于斷頭器上斷頭，開胸后迅速取出心臟并置冰水停搏，懸主動脈于Langendorff裝置上行逆行灌流。K-H液常規(guī)恒壓(76 mmHg)灌流，以95%O2+5%CO2飽和，維持灌流液溫度37℃。將充水乳膠囊由切開的左心耳處插入至左心室，囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器，由Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)記錄和分析。各組心臟均穩(wěn)定20 min后，進(jìn)行實(shí)驗處理。大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只:①I/R損傷組:結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支30 min模擬局部心肌缺血，隨后松開結(jié)扎線恢復(fù)灌流120 min作為單純I/R;②法舒地爾組:同I/R組，但在缺血前10 min至再灌注初期10 min給予Rho激酶抑制劑法舒地爾30μmol/L，共灌流50 min;③CYA組:同I/R組，但在缺血前10 min至再灌注初期10 min給予 ALDH2抑制劑 CYA 1 mmol/L，共灌流50 min;④法舒地爾+CYA組(聯(lián)合組)。

1.3 左心室功能評價 向插入左心室內(nèi)的乳膠囊注水使左心室舒張末壓(LVEDP)維持于4～8 mmHg，連續(xù)記錄左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)和LVEDP等各項指標(biāo)，并計算左心室做功量(RPP)的變化，RPP=LVDP×HR。

1.4 大鼠灌流心臟冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)測定 分別在復(fù)灌第5和第10分鐘收集冠脈流出液，利用分光光度法測定LDH的含量，單位以U/L表示。

1.5 RT-PCR檢測ALDH2、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá) 采用Trizol一步法提取左心室心尖部組織總RNA，取總RNA3μl為模板，用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA 1.5μl為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min后，以①95℃50 s變性;②ALDH2退火溫度 59.8℃ 45 s，Bax退火溫度62.2℃ 45 s，Bcl-2退火溫度57.6℃ 45 s，β-actin退火溫度55.5℃45 s;③72℃60 s，反應(yīng)30個循環(huán)，最后一輪延伸10 min。將4μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶顯色。GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍攝記錄，使用圖像分析軟件對泳帶進(jìn)行光密度掃描作半定量分析，以目的基因與內(nèi)參對照的積分吸光度比值(ALDH2/β-actin;Bcl-2/β-actin;Bax/βactin)表示mRNA相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，各組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 左心室功能改變 單純I/R組缺血與復(fù)灌期間LVEDP上抬，LVDP降低，±dp/dtmax降低，RPP減少;與單純I/R組相比，法舒地爾組降低了LVEDP，明顯促進(jìn)了LVDP、±dp/dtmax的恢復(fù)，增加了RPP;與法舒地爾組相比，ALDH2抑制劑CYA減弱了法舒地爾的作用，使LVDP降低、±dp/dtmax降低、RPP減少。見表1。

2.2 冠脈流出液中LDH含量測定 與單純I/R相比，法舒地爾組冠脈流出液中LDH釋放減少，CYA組LDH釋放增加;與法舒地爾組相比，聯(lián)合組LDH釋放增加。見表2。

2.3 心肌組織ALDH2、Bcl-2和BaxmRNA的表達(dá) 與單純I/R組相比，法舒地爾組ALDH2mRNA表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比值增高;與法舒地爾組比較，聯(lián)合組ALDH2 mRNA表達(dá)顯著減少，Bcl-2/Bax比值降低。見表3，圖1和圖2。梗死后心衰小鼠心肌細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，抑制p53的表達(dá)〔9〕。越來越多的證據(jù)支持ALDH2可能是行之有效的心肌保護(hù)因子，成為目前心血管疾病發(fā)病機(jī)制研究新的熱點(diǎn)。本實(shí)驗結(jié)果提示CYA抑制ALDH2表達(dá)后減弱了法舒地爾的心肌保護(hù)作用，ALDH2可能是Rho激酶的下游信號途徑。

表1 離體大鼠心臟血流動力學(xué)參數(shù)(n=8，±s)

表1 離體大鼠心臟血流動力學(xué)參數(shù)(n=8，±s)

與I/R組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與法舒地爾組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

120 min LVDP(mmHg) I/R組 62.69±6.76 46.44±5.20 27.49±5.63 21.40±4.67參數(shù) 缺血前 缺血30 min 復(fù)灌60 min 復(fù)灌法舒地爾組 69.50±4.83 45.79±7.33 37.90±7.462) 32.89±7.092)CYA組 64.11±10.42 29.93±11.85 23.90±0.244) 18.29±1.264)聯(lián)合組 62.05±14.74 41.47±13.86 28.66±8.904) 21.55±7.434)LVEDP(mmHg) I/R組 5.35±0.41 13.19±5.05 33.54±7.49 26.81±9.43法舒地爾組 5.92±0.57 12.59±2.58 19.84±2.552) 15.96±2.591)CYA組 6.34±0.33 34.19±9.59 43.95±9.762)4) 41.09±11.612)4)聯(lián)合組 6.45±0.63 15.35±5.37 23.33±5.452) 17.46±4.711)+dp/dtmax(mmHg/s)(×103) I/R組 1.79±0.26 1.36±0.14 0.88±0.05 0.73±0.07法舒地爾組 2.03±0.19 1.39±0.19 1.19±0.192) 1.04±0.172)CYA組 1.79±0.53 0.90±0.33 0.76±0.064) 0.64±0.044)聯(lián)合組 1.75±0.57 1.12±0.34 0.87±0.234) 0.68±0.194)-dp/dtmax(mmHg/s)(×103) I/R組 1.28±0.14 0.94±0.06 0.60±0.03 0.51±0.02法舒地爾組 1.39±0.09 0.91±0.08 0.69±0.052) 0.60±0.052)CYA組 1.21.±0.19 0.57±0.17 0.50±0.012)4) 0.43±0.0021)4)聯(lián)合組 1.22±0.28 0.75±0.18 0.55±0.102) 0.46±0.081)4)RPP(mmHg/s)(×103) I/R組 20.14±0.83 13.46±2.32 6.64±0.07 4.75±0.25法舒地爾組 20.62±1.62 12.16±2.67 8.93±1.302) 5.70±0.432)CYA組 18.97±1.19 8.17±3.28 6.41±0.174) 4.74±0.083)聯(lián)合組 19.56±2.23 10.73±1.70 5.95±1.464) 3.93±1.111)4)

表3 各組心肌組織中ALDH 2 m RNA表達(dá)、Bcl-2/Bax比值變化(n=8，±s)

表3 各組心肌組織中ALDH 2 m RNA表達(dá)、Bcl-2/Bax比值變化(n=8，±s)

與正常組比較:1)P＜0.01;與I/R組比較:2)P＜0.05;與法舒地爾組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 ALDH2/β-actin Bcl-2/Bax I/R組 0.38±0.031) 0.31±0.051)法舒地爾組 0.45±0.072) 0.36±0.011)2)CYA組 0.37±0.041)4) 0.26±0.031)2)4)聯(lián)合組 0.34±0.031)4) 0.32±0.011)3)

圖1 ALDH2 m RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

Rho激酶信號途徑、ALDH2均與細(xì)胞凋亡密切聯(lián)系。體外實(shí)驗證明，腺病毒過度表達(dá)激活的RhoA作用于Rho激酶可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，通過上調(diào)Bax表達(dá)誘導(dǎo)線粒體途徑的心肌細(xì)胞凋亡〔10〕。本實(shí)驗室前期工作〔11〕觀察到激動ALDH2可上調(diào)心肌Bcl-2 mRNA，降低 Bax mRNA，Bcl-2/Bax比值增加;阻斷ALDH2后，Bcl-2 mRNA水平下調(diào)，BaxmRNA水平升高，加重心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗結(jié)果提示抑制Rho激酶上調(diào)ALDH2 mRNA表達(dá)的同時亦抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上，法舒地爾抑制Rho激酶信號通路發(fā)揮心肌保護(hù)和抗凋亡作用可能與激動ALDH2有關(guān)，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

圖2 Bcl-2 mRNA和Bax m RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

I/R損傷發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。氧化應(yīng)激、鈣超載、血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞學(xué)說等已經(jīng)得到公認(rèn)，研究報道，Rho激酶參與了心臟I/R損傷，抑制Rho激酶可阻止Bcl-2的下調(diào)、降低炎癥反應(yīng)、減少心肌梗死面積、降低心肌細(xì)胞凋亡〔1，5，6〕。Rho激酶抑制劑法舒地爾可以發(fā)揮抗心肌 I/R 損傷作用。本實(shí)驗結(jié)果提示法舒地爾抑制Rho激酶發(fā)揮了抗心肌I/R損傷作用，且可能與激動ALDH2有關(guān)。ALDH2是線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶。研究發(fā)現(xiàn)ALDH2在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，參與了心力衰竭、AS、冠心病、高血壓等疾病的發(fā)生。ALDH2缺失與機(jī)體內(nèi)疾病的發(fā)生是否相關(guān)引起關(guān)注，Takagi等〔7〕發(fā)現(xiàn)ALDH2基因缺失是日本男性人群中心肌梗死發(fā)生的危險因素。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使小鼠ALDH2表達(dá)增加可對抗慢性乙醇中毒引起的心力衰竭的發(fā)生、心功能的降低及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而發(fā)揮保護(hù)作用〔8〕。轉(zhuǎn)染ALDH2腺病毒載體使ALDH2基因高表達(dá)，可以有效地抑制急性心肌

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M echanism exploration of aldehyde dehydrogenase 2 in the cardioprotection of fasudil

YE Hong-W ei，KANG Pin-Fang，WANG Hong-Ju，et al.
Departm ent of Physiology，the First Affiliated Hospital of Bengbu M edical College，Bengbu 233004，Anhui，China

ObjectiveTo investigate whether aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)was involved in the cardioprotection of fasudil，the inhibitor of Rho-kinase，and explore themechanism.MethodsHearts isolated from male SD rats were subjected to 30 minutes of regional ischemia(occlusion of left anterior descending artery)followed by 120 minutes of reperfusion.The experiment was divided into 4 groups:I/R，F(xiàn)asudil，ALDH2 inhibitor CYA and Fasudil+CYA groups.The left ventricular hemodynamics were continuous recorded，the coronary effluentwas collected during the reperfusion period to determinate lactate dehydrogenase(LDH)levels.ALDH2 mRNA expression and the ratio of Bcl-2/Bax were detected by RT-PCR.ResultsCompared with I/R group，fasudil significantly increased the restore of left ventricular developed pressure，maximal rise/fall rate of left ventricular pressure and rate pressure product，reduced LDH release during reperfusion period，ALDH2mRNA expression and the ratio of Bcl-2/Bax were increased.CYA，the ALDH2 inhibitor reduced the role of fasudil，which inhibited the recovery of ventricular hemodynamical parameters，increased LDH release，it also inhibited the expression of ALDH2 mRNA，and Bcl-2/Bax ratio was decreased.ConclusionsFasudil can play myocardial protection by inhibiting Rho-kinase signaling pathway，and maybe related with excitement of ALDH2 and inhibiting apoptosis happening.

Heart;Ischemia/reperfusion injury;Aldehyde dehydrogenase 2;Rho-kinase;Fasudil;Cyanamide

R363.2

A

1005-9202(2013)05-1070-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.039

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81000074);安徽省自然科學(xué)基金資助項目(No.090413097)

1 安徽省組織移植重點(diǎn)實(shí)驗室

2 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

高 琴 (1977-)，女，博士，副教授，主要從事心血管生理學(xué)研究。

葉紅偉(1984-)，男，碩士，主要從事心血管生理學(xué)研究。

〔2012-02-16收稿 2012-04-12修回〕

(編輯 曹夢園)