朱佳蕾 鄧夏珩 高 麗 顧 昊 沈 偉 郭 軍

(南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇 南京 210029)

白藜蘆醇通過(guò)核因子-κB信號(hào)通路抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶功能上調(diào)

朱佳蕾 鄧夏珩 高 麗1顧 昊1沈 偉1郭 軍2

(南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇 南京 210029)

目的揭示白藜蘆醇抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9功能上調(diào)的分子機(jī)制及其與核因子(NF)-κB信號(hào)通路聯(lián)系。方法建立大鼠四動(dòng)脈前腦缺血模型，采用免疫印跡技術(shù)觀察缺血后再灌海馬腦區(qū)MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位的變化;給予自由基清除劑白藜蘆醇或NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)，識(shí)別NF-κB信號(hào)通路是否參與了白藜蘆醇對(duì)腦缺血MMP-9蛋白表達(dá)的調(diào)控。結(jié)果腦缺血/再灌誘導(dǎo)海馬腦區(qū)MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位增加(P＜0.05)。PDTC能一定程度的抑制缺血后MMP-9基因表達(dá)(P＜0.05)。白藜蘆醇能顯著抑制腦缺血NF-κB核易位和MMP-9表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論腦缺血再灌，誘導(dǎo)MMP-9依賴NF-κB通路的蛋白水平增加，白藜蘆醇能通過(guò)抑制NF-κB通路下調(diào)MMP-9的功能，繼而阻斷MMP-9激活介導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解及海馬腦區(qū)損傷。

腦缺血;白藜蘆醇;MMP-9;NF-κB

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組活性依賴鈣離子和鋅離子的中性蛋白酶家族，在體內(nèi)組成性表達(dá)，參與降解各種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)〔1〕?，F(xiàn)已識(shí)別20多種蛋白，其中MMP-9是MMPs家族的主要成員之一。通過(guò)誘導(dǎo)胞外基質(zhì)異常降解，MMP-9參與了多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生，如髓鞘脫失、血腦屏障損傷等，而MMP-9在缺血性腦損傷的精確分子調(diào)控機(jī)制有待探明。有研究表明:MMP-9的表達(dá)上調(diào)及功能異常與自由基產(chǎn)生密切相關(guān)，且其啟動(dòng)序列具有因子(NF)-κB的識(shí)別位點(diǎn)。因而，本研究擬采用具有自由基清除功能的白藜蘆醇及NF-κB抑制劑，檢測(cè)腦缺血后海馬腦區(qū)自由基生成及NF-κB信號(hào)通路對(duì)MMP-9基因表達(dá)及功能上調(diào)的影響，繼而揭示天然化合物白藜蘆醇能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制MMP-9，阻斷缺血后胞外基質(zhì)降解，保護(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重220～250 g，室溫下飼養(yǎng)。

1.2 抗體 MMP-9和β-actin抗體來(lái)源于武漢博士德生物工程有限公司;NF-κB抗體是Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.3 其他試劑 白藜蘆醇購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)來(lái)源于碧云天生物技術(shù)研究所，是國(guó)外分裝產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 前腦缺血模型 采用四動(dòng)脈阻斷法建立前腦缺血模型〔2〕，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程符合南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)定。水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠;俯臥位固定大鼠，暴露第2頸椎，電灼兩側(cè)椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞;腹側(cè)頸正中切口并分離頸總動(dòng)脈，絲線標(biāo)記;電灼24 h后，動(dòng)脈夾夾住雙側(cè)頸總動(dòng)脈，使大鼠腦部供血完全阻斷;10 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，再灌注12和24 h。該過(guò)程要求大鼠在動(dòng)脈充分阻斷時(shí)須滿足下列條件:(1)腦電波完全平坦，(2)瞳孔擴(kuò)張，(3)無(wú)角膜反射，(4)直腸溫度穩(wěn)定(約37℃)。對(duì)照組大鼠進(jìn)行相似的外科手術(shù)但無(wú)動(dòng)脈阻斷。藥物注射實(shí)驗(yàn)組，腹腔注射自由基清除劑白藜蘆醇(200 mg/kg)或相同劑量的生理鹽水。每組動(dòng)物接受相同的手術(shù)準(zhǔn)備和操作方式，以減少手術(shù)過(guò)程造成的誤差。

1.4.2 腦室注射 大鼠經(jīng)乙醚麻醉后固定于腦立體定位儀上，使顱骨保持水平位置，用過(guò)氧化氫灼燒暴露前囟點(diǎn)。然后用直徑1.5 mm的鉆頭鉆孔，位置為:前自后0.8 mm，旁開(kāi)1.5 mm，深3.5 mm。利用微量注射器通過(guò)單側(cè)腦室注射吡咯二硫氨基甲酸酯(100 mmol/L，4μl)。

1.4.3 各亞細(xì)胞組分的分離和蛋白樣本制備 大鼠斷頭取腦，快速分離海馬，并置于1∶10(W/V)的冰冷勻漿液(HEPES 50，pH 7.4，KCl 100，Na3VO41，NaF 50，PMSF 1 mmol/L)中，勻漿器高速破碎組織。4℃低溫離心10 min取上清，為胞質(zhì)和胞膜組分，沉淀為胞核。加勻漿液懸浮胞核沉淀，超聲破碎，離心10 min，取上清為胞核成分。Bradford法測(cè)定蛋白含量并將組織樣本調(diào)為等量蛋白濃度，置－80℃保存或直接100℃ ×5 min變性蛋白樣本。

1.4.4 電泳與免疫印跡分析 采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜(NC)。3%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，室溫下一抗孵育4 h，接著TBST洗膜，加入相應(yīng)酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合羊抗兔或抗鼠IgG(1∶10 000)，室溫反應(yīng)2 h，洗膜后，滴加顯色劑，暗室膠片曝光。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血/再灌誘導(dǎo)海馬腦區(qū)MMP-9蛋白水平變化 為了檢測(cè)缺血/再灌大鼠海馬腦區(qū) MMP-9蛋白水平變化，采用MMP-9和抗體檢測(cè)了MMP-9和β-actin蛋白含量變化。免疫印跡結(jié)果表明:前腦缺血再灌24 h，能誘導(dǎo)pro-MMP-9蛋白含量顯著上調(diào)(P＜0.05)，為空白對(duì)照組的2.45倍，而β-actin蛋白水平基本保持穩(wěn)定。提示前腦缺血誘導(dǎo)海馬腦區(qū)MMP-9蛋白含量增加，其功能上調(diào)與缺血性腦損傷密切聯(lián)系，見(jiàn)圖1。

2.2 腦缺血/再灌海馬腦區(qū)NF-κB核易位變化 為評(píng)價(jià)腦缺血后核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對(duì)MMP-9基因表達(dá)的潛在機(jī)制，采用差速離心結(jié)合免疫印跡技術(shù)觀察了不同亞細(xì)胞組分NF-κB及β-actin蛋白水平變化。結(jié)果表明腦缺血再灌12 h能誘導(dǎo)NF-κB胞漿蛋白含量減少(5.88%，P＜0.05)，胞核蛋白顯著增加(429.4%，P＜0.05)，而總蛋白水平基本保持不變(113.2%，P＞0.05)，同時(shí)β-actin總蛋白水平基本穩(wěn)定。提示前腦缺血誘導(dǎo)NF-κB核易位增加和功能上調(diào)，可能參與了缺血后腦組織基因表達(dá)調(diào)節(jié)。見(jiàn)圖2。

2.3 NF-κB信號(hào)通路對(duì)腦缺血后pro-MMP-9蛋白水平的調(diào)節(jié)為了證實(shí)NF-κB信號(hào)通路參與了MMP-9基因表達(dá)調(diào)控，采用腦室注射NF-κB抑制劑PDTC，抑制NF-κB信號(hào)通路。PDTC能有效下調(diào)缺血/再灌海馬腦區(qū)MMP-9蛋白表達(dá)增加，與溶劑組比降低了17.5%，兩者差異顯著(P＜0.05)。提示缺血誘導(dǎo)的NF-κB激活參與了MMP-9基因表達(dá)調(diào)控，是其蛋白水平增加及功能上調(diào)的重要分子機(jī)制。見(jiàn)圖3。

圖1 免疫印跡檢測(cè)腦缺血再灌海馬組織pro-MMP-9蛋白含量變化

圖2 W estern印跡結(jié)合亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)腦缺血再灌海馬組織NF-κB蛋白水平變化

圖3 免疫印跡結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)分析腦缺血再灌NF-κB抑制劑(PDTC)對(duì)pro-MMP-9蛋白水平的影響

2.4 白藜蘆醇對(duì)腦缺血后NF-κB核易位和MMP-9表達(dá)的影響 為了闡明自由基清除對(duì)腦缺血NF-κB功能及MMP-9蛋白水平的影響，腹腔注射白藜蘆醇。免疫印跡檢測(cè)表明:白藜蘆醇能顯著性抑制缺血后NF-κB胞漿含量減少和MMP-9蛋白水平增加(80.39%，156.9%)，與溶劑組比有顯著差異(23.53%，264.7%，P＜0.05)。提示腦缺血誘導(dǎo)NF-κB功能上調(diào)及其介導(dǎo)的MMP-9基因表達(dá)與自由基生成有密切聯(lián)系，白藜蘆醇通過(guò)抑制NF-κB通路，下調(diào)MMP-9胞外基質(zhì)降解功能，減弱腦缺血后神經(jīng)損傷。見(jiàn)圖4。

圖4 白藜蘆醇對(duì)腦缺血后NF-κB核易位和MMP-9表達(dá)的影響

3 討論

有研究表明〔3〕:白藜蘆醇能清除超氧陰離子、NO、羥基自由基等，減少H2O2產(chǎn)生，顯著抑制氧化性指標(biāo)丙二醛(MDA)、乳酸(LD)含量增加，恢復(fù)超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱苷肽(GSH)水平，從而減少腦梗死和水腫體積，發(fā)揮氧自由基清除劑的保護(hù)功效〔4，5〕。也有學(xué)者認(rèn)為白藜蘆醇對(duì)腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用與其抗炎功效、雌激素活性、調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的釋放等有關(guān)〔6～11〕。本研究揭示，白藜蘆醇能通過(guò)抑制NF-κB核易位，下調(diào)腦缺血MMP-9蛋白水平，阻斷MMP-9介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解和血腦屏障損傷，繼而發(fā)揮相關(guān)神經(jīng)保護(hù)功能。

MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶。近年越來(lái)越多的證據(jù)表明:激活的MMP-9能降解血管周圍基膜主要成分Ⅳ、Ⅴ型明膠膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白〔12〕，觸發(fā)組織繼發(fā)性損傷。MMP-9被確認(rèn)能定位于腦內(nèi)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。腦缺血后，MMP9含量增加，可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞神經(jīng)細(xì)胞間的聯(lián)系和血腦屏障〔13，14〕，繼而導(dǎo)致炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)侵入腦組織，誘導(dǎo)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。同時(shí)血腦屏障的破壞也促進(jìn)了毛細(xì)血管內(nèi)水分和血漿蛋白的外滲，造成血管源性腦組織水腫〔15〕;兩者共同觸發(fā)腦組織廣泛損傷，成為腦內(nèi)神經(jīng)功能喪失的重要誘因。

MMP-9的基因表達(dá)受多種因素調(diào)控，其中其基因啟動(dòng)序列－670～ －599，被識(shí)別是 NF-κB p65結(jié)合位點(diǎn)，能誘導(dǎo) MMP-9基因轉(zhuǎn)錄起始〔12〕。腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):NF-κB的高度激活伴隨MMP-9的高表達(dá)，是細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要調(diào)控機(jī)制〔16，17〕。本研究證實(shí)，腦缺血再灌能刺激 NF-κBp65 的核轉(zhuǎn)位增加，且抑制NF-κB功能能顯著抑制缺血后MMP-9蛋白水平。因而，作為核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κBp65參與了腦缺血MMP-9基因表達(dá)調(diào)控，密切聯(lián)系海馬腦區(qū)組織損傷。

綜上所述，白藜蘆醇作為自由基清除劑，能通過(guò)抑制腦缺血誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位，繼而下調(diào)MMP-9基因表達(dá)和功能上調(diào)，阻止缺血后MMP-9對(duì)胞外基質(zhì)的降解，穩(wěn)定腦組織內(nèi)環(huán)境，降低腦神經(jīng)元損傷，發(fā)揮生物學(xué)保護(hù)功能。本研究闡明了腦缺血神經(jīng)損傷的分子機(jī)制及白藜蘆醇阻止神經(jīng)損傷的新途徑，能為臨床治療缺血性腦卒中提供有益的啟示。

1 Wu D，Zheng H，Zhu ZJ，et al.Study on tumor cell dissemination during orthotopic liver transplantation for hepatocellular carcinoma and its correlation with MMP-9 and CD44v6〔J〕.Chin JModern Med，2008;18(11):1521-4.

2 Cao Q，Qian M，Wang XF，et al.Negative feedback regulation of Raf/MEK/ERK cascade in a ratmodel of cerebral ischemic preconditioning〔J〕.Neurochem Res，2011;36(1):153-62.

3 Sinha K，Chaudhary G，Gupta YK.Protective effect of resveratrol against oxidative stress inmiddle cerebral artery occlusionmodel of stroke in rats〔J〕.Life Sci，2002;71(6):655-65.

4 LiH，Yan ZY，Zhu J，etal.Neuroprotective effects of resveratrol on ischemic injurymediated by improving brain energymetabolism and alleviating oxidative stress in rats〔J〕.Neuropharmacology，2011;60(2-3):252-8.

5 Seema Y，F(xiàn)ahim A，Muzamil A，et al.Resveratrol exerts its neuroprotective effect by modulating mitochondrial dysfunctions and associated cell death during cerebral ischemia〔J〕.Brain Res，2009;1250:242-53.

6 Yang Yumin，Wang Xiaoling，Zhang Li.Inhibitory effects of resveratrol on platelet activation induced by thromboxane A(2)receptor agonist in human platelets〔J〕.Am JChin Med，2011;39(1):145-59.

7 Sun Albert Y，Wang Qun，Simonyi Agnes.Resveratrol as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases〔J〕.Mol Neurobiol，2010;41(2-3):375-83.

8 Mohd Moshahid Khan，Ajmal Ahmad，Tauheed Ishrat，et al.Resveratrol attenuates 6-hydroxydopamine-induced oxidative damage and dopamine depletion in ratmodelof Parkinson's disease〔J〕.Brain Res，2010;1328:139-51.

9 Jin A Shin，Hyunah Lee，Yoo-Kyoung Lim，et al.Therapeutic effects of resveratrol during acute periods following experimental ischemic stroke〔J〕.JNeuroimmunol，2010;227:93-100.

10 Saleh MC，Connell BJ，Saleh TM.Resveratrol preconditioning induces cellular stress proteins and asmediated via NMDA and estrogen receptors〔J〕.Neuroscience，2010;166:445-54.

11 Chao Li，Zhiying Yan，Jing Yang，et al.Neuroprotective effects of resveratrol on ischemic injurymediated bymodulating the release of neurotransmitter and neuromodulator in rats〔J〕.Neurochemi Int，2010;56:495-500.

12 Chandrasekar B，Mummidi S，Mahimainathan L，et al.Interleukin-18-induced human coronary artery smoothmuscle cellmigration is dependent on NF-kappaB-and AP-1-mediated matrix metalloproteinase-9 expression and is inhibited by atorvastatin〔J〕.JBiol Chem，2006;281(22):15099-109.

13 Power C，Henry S，Del Bigio MR，et al.Intracerebral hemorrhage induces macrophage activation and matrix metalloproteinases〔J〕.Ann Neurol，2003;53(6):731-42.

14 Wang C，Deng X，Li X，et al.Matrix metalloproteinase 9 expression is induced by Epstein-Barr virus LMPI via NF-κB or AP-1 sigaling pathway in nasopharyngeal carcinoma cells〔J〕.Chin J Oncol，2002;24(1):9-13.

15 Rosenberg GA，Navratil M.Metalloproteinase inhibition blocks edema in intracerebral hemorrhage in the rat〔J〕.Neurology，1997;48(4):921-6.

16 PizziM，Sarnico I，Lanzillotta A，et al.Post-ischemic brain damage:NF-kappaB dimer heterogeneity as a molecular determinant of neuron vulnerability〔J〕.FEBS J，2009;276(1):27-35.

17 Goebeler M，Gillitzer R，Kilian K，etal.Multiple signaling pathways regulate NF-KappaB dependent transcription of themonocyte chemoattractant protein1 gene in primary endothelial cell〔J〕.Blood，2001;97(1):46-55.

Effect of resveratrol on NF-κB-induced upregulation of MMP-9 function follow ing cerebral ischem ia

ZHU Jia-Lei，DENG Xia-Heng，GAO Li，et al.
Laboratory Center for Basic M edical Sciences，Nanjing M edical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China

ObjectiveTo explore themolecularmechanisms underlying inhibiting MMP-9 function increasing resulted from cerebral ischemia by resveratrol and its relationswith NF-κB signaling pathway.MethodsFour arterial forebrain ischemiamodel of ratswere established and the changes of MMP-9 protein and NF-κB nuclear transfer were observed by adopting immunoblot assay after ischemia reperfusion in hippocampus.ResultsAfter ischemia reperfusion was adopted，MMP-9 protein level in hippocampus and NF-κB nuclear transfer were induced to increase.PDTC inhibited the increasing of MMP-9 expression to a certain degree after ischemia reperfusion.Resveratrol significantly inhibited NF-κB nuclear transfer and MMP-9 expression after ischemia reperfusion.ConclusionsMMP-9 expression depends on NF-κB pathway is increased as induced by reperfusion after cerebral ischemia.Resveratrol can inhibit the function of MMP-9 through NF-κB pathway，therefore blocking the extracellularmatrix degradation and the damage to the hippocampus areawhich is resulted from the activation of MMP-9.

Cerebral ischemia;Resveratrol;MMP-9;NF-κB

R34

A

1005-9202(2013)05-1073-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.040

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170714);南京市科技發(fā)展計(jì)劃科研項(xiàng)目(200901081)

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院

2 南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系

沈 偉(1971-)，男，副主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事退行性神經(jīng)病變研究。

朱佳蕾(1989-)，女，在讀本科，主要從事神經(jīng)退行性疾病藥理學(xué)研究。

〔2011-11-18收稿 2012-03-14修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)