白海嬌，王亞敏，丁 一

(1.天津市藥品檢驗所，天津 300070; 2.中國藥品審評中心，北京 100038; 3.天津藥物研究院，天津 300193)

近年來，多肽類藥物成為藥物研發(fā)的熱點，申報的多肽類新藥也逐漸增多，這類新藥與普通的化學(xué)藥品相比，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差，生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面均有所不同。

有關(guān)物質(zhì)檢查是控制藥品安全性的重要措施。目前，多肽類藥物多采用生化提取、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和固相合成工藝制備，其工藝特點決定了產(chǎn)物的雜質(zhì)含量較高。同時多肽藥物具有以下特點:①穩(wěn)定性差，化學(xué)和構(gòu)象不穩(wěn)定性;②易被胃腸道中的蛋白質(zhì)水解酶降解;③體內(nèi)生物半衰期短，消除或降解迅速;④脂溶性差，不易通過生物屏障等。因此，多肽藥物通常選擇注射途徑給藥［1］，其有關(guān)物質(zhì)檢測更值得關(guān)注。

普通化學(xué)藥物多采用HPLC、TLC 等方法檢測有關(guān)物質(zhì)［1］，在方法學(xué)驗證時通常對藥品進(jìn)行強酸、強堿、光、熱和氧化破壞，考查降解產(chǎn)物是否能與主峰(或斑點)分離［2］，而這種強制降解試驗在多肽類藥物的有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)研究中是不十分適用的。由于多肽類藥物很不穩(wěn)定，對于酸、堿、光、熱等因素和微生物、金屬離子、運輸過程中的振動等因素均比較敏感，因此在劇烈的破壞條件下，主成分基本全部被破壞，不僅產(chǎn)生過多的雜質(zhì)，難于與主成分完全分離，而且也無法觀察主要雜質(zhì)的變化情況和影響穩(wěn)定性的主要因素。關(guān)于多肽類藥物如何進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)驗證，目前沒有共識的方法，由于經(jīng)驗有限，這里僅提一點筆者不成熟的意見。

對多肽進(jìn)行常規(guī)強制降解試驗不可取的原因是:在實際生產(chǎn)、貯存條件下，主成分不會發(fā)生如此強烈的降解，因此試驗結(jié)果不理想不能徹底否定檢測方法的可行性。引起多肽藥物不穩(wěn)定的原因主要有水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、β 消除、凝聚、沉淀和吸附等。多肽類藥物雜質(zhì)檢測的方法學(xué)驗證，首先應(yīng)考慮合成中可能產(chǎn)生的中間體、同系物和錯肽等副產(chǎn)物是否可與主成分分離，并有效檢出?？梢圆捎么制愤M(jìn)樣分析，中間體可采用外加的方法考查分離情況。對于運輸、貯藏中產(chǎn)生、增加的雜質(zhì)，可以采用適當(dāng)改變藥品的處方和貯藏條件的方法考查，例如采用改變酸堿度、貯藏條件的光照強度、少加或不加抗氧劑、提高貯藏溫度、搖床振動、反復(fù)凍融等方法，加速多肽降解。當(dāng)然由于考查條件比較溫和，可以適當(dāng)延長考查時間，這樣即可以考查雜質(zhì)檢測方法的可行性，也可以對制劑的處方選擇和貯藏條件的選擇提供一定的幫助。

在這類藥物的雜質(zhì)考查時，應(yīng)該有針對性的著重考查幾種檢測難度較大、對藥物安全性有重要影響的雜質(zhì)。多肽的聚合物是影響藥物安全性的重要因素之一，由半胱氨酸的巰基形成的二硫鍵是形成二聚體、三聚體的主要共價鍵，對于含有一個半胱氨酸的多肽一定應(yīng)考慮二聚體檢測，含有兩個半胱氨酸的就應(yīng)該考慮三聚體甚至多聚體的檢測了。由于多肽合成、提取過程中多存在變性和復(fù)性的情況，存儲過程中也會有少量多肽變性聚合，因此檢測高分子量物質(zhì)是非常必要的。通常采用高效分子排阻色譜法(HPSEC)以親水硅膠、凝膠為填充劑，對于已知的二聚體、三聚體應(yīng)采用外標(biāo)法或相對保留時間方法確定峰位。對于已知結(jié)構(gòu)的大分子多肽，主峰前的雜質(zhì)峰均可按高分子物質(zhì)計算，但對于生化提取的多肽類制劑，由于成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)不確定，多采用胰島素等已知分子量的蛋白為參比物質(zhì)，只檢測分子量大于該蛋白的高分子物質(zhì)，有時還要配合沉淀法，定性檢測蛋白質(zhì)。

對于合成多肽，其旋光異構(gòu)體也是值得注意的問題，雖然，很多人認(rèn)為固相合成極少發(fā)生外消旋化，但相關(guān)研究表明，消旋異構(gòu)體還是存在的［3］。例如有資料表明腸降血糖素類似物艾塞那肽，采用SCX -HPLC檢查早期批次產(chǎn)品的純度僅88.0%，其中雜質(zhì)［N -His1］高達(dá)9.8%。因此至少在早期的有關(guān)物質(zhì)研究中，應(yīng)對消旋異構(gòu)體進(jìn)行充分的研究。

值得指出的是，目前國內(nèi)多肽藥物在進(jìn)行雜質(zhì)檢測時多采用一種色譜系統(tǒng)，使用最多的是反相HPLC，C18色譜柱，等度洗脫。事實上，由于反相HPLC 主要是利用待檢物質(zhì)在固定相和流動相中分配系數(shù)不同的原理，因此一般在等度洗脫條件下，能檢出的雜質(zhì)是非常有限的，極性大的物質(zhì)沒有保留，極性過低的物質(zhì)又沒有洗脫出來，因此一般降解產(chǎn)物復(fù)雜的多肽類藥物應(yīng)采用梯度洗脫方式檢測［4］。多是先采用高水相的流動相洗脫，以利于主峰與類似物峰的分離，然后梯度洗脫增加有機(jī)相比例，將水溶性差的聚合物和錯肽洗出。但國內(nèi)常采用的純水相與純有機(jī)相在線梯度混合的洗脫方式是不可取的，特別是對于水相含鹽量較高的流動相，由于色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定，容易造成雜質(zhì)高估或低估。

同時由于反相色譜柱對高親水性物質(zhì)檢測的局限，應(yīng)采用其他色譜系統(tǒng)和其他類型色譜柱，如正相色譜、離子交換系統(tǒng)、C3和C8色譜柱等，對制備與降解產(chǎn)生的極性較大的分子、離子進(jìn)行考查，作為有關(guān)物質(zhì)研究的一部分。除對已知雜質(zhì)可采用TLC 法檢測外，一般不建議采用薄層色譜控制雜質(zhì)。

有關(guān)物質(zhì)檢測方法是否能比較全面地檢出雜質(zhì)，并且能反映藥物質(zhì)量變化，物料平衡應(yīng)該是重要的考量因素。無論是在穩(wěn)定性研究中，還是在上述有關(guān)物質(zhì)的方法學(xué)研究試驗中，含量的降低應(yīng)該在雜質(zhì)檢測中有相應(yīng)的反映。但兩者存在多大差距，就認(rèn)為雜質(zhì)檢測不適用，這個問題尚沒有一個明確的限度。筆者認(rèn)為如果含量下降超過2%，并且兩者差距超過1%，就值得進(jìn)一步研究。在審評中經(jīng)常見到在影響因素和加速試驗中，含量下降已經(jīng)很大，但有關(guān)物質(zhì)卻沒有明顯增加，提示有關(guān)物質(zhì)的檢測方法無法完全檢出雜質(zhì)，也不能控制貯藏過程中變化較大的雜質(zhì)。例如某企業(yè)申報的胸腺五肽注射液，加速試驗6 個月含量下降20%以上，有關(guān)物質(zhì)僅由1%增加為3.5%，補充料顯示由于按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢測有關(guān)物質(zhì)，進(jìn)樣的采集時間為主峰保留時間的2 倍，而2.5 倍主峰保留時間時，有較大的雜質(zhì)峰出現(xiàn)，并且加速試驗中增加明顯，而這一雜質(zhì)沒有計算，有關(guān)物質(zhì)檢測存在很大缺陷。

當(dāng)然，即使采用高效液相色譜法檢測含量，存在1% ～2%的誤差也是合理的，因此在進(jìn)行物料平衡考查時，研究者應(yīng)該特別注意操作的準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性以及所使用的對照品質(zhì)量應(yīng)保持一致。但是，對于多數(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的多肽，常采用藥物效價測定法控制含量，例如干擾素采用細(xì)胞病變抑制法。其效價測定結(jié)果說明活性蛋白的含量，并且，檢測結(jié)果一般允許在很大的范圍內(nèi)波動，因此與雜質(zhì)變化沒有直接的對應(yīng)關(guān)系。同樣，生化提取多肽常采用的UV 法和顯色法，由于專屬性差，供試品中酪氨酸和色氨酸的含量對檢測結(jié)果有很大影響，一般其數(shù)據(jù)也不用于物料平衡考查。

應(yīng)該說明的是，無論HPLC 法的含量測定，還是有關(guān)物質(zhì)檢測，都是只能區(qū)分多肽一級結(jié)構(gòu)的檢測。多肽的二級結(jié)構(gòu)與溶劑、pH 和溫度有密切關(guān)系，如果空間構(gòu)象改變而形成的非活性肽，其理化性質(zhì)(如溶解性)變化不明顯，這些檢測方法經(jīng)常是不能區(qū)分的。因此，至少在研制初期，進(jìn)行效價測定是很有必要的，研究比較深入后，可以取消生物檢測法。例如，初期胰島素制劑均采用小鼠血糖檢測法計算效價，但目前胰島素基本都采用HPLC 法控制含量，質(zhì)量比較穩(wěn)定。

總之，由于多肽類藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，其質(zhì)量控制風(fēng)險比較大。同時，作為藥物研發(fā)的新熱點，其有關(guān)物質(zhì)檢測的很多問題都處于探索階段，例如雜質(zhì)檢測方法學(xué)驗證的合理性、免疫原性雜質(zhì)的檢測與定量等問題，在這種情況下，有時可以采用藥理學(xué)檢測項目進(jìn)行補充，比如異常毒性、降壓物質(zhì)等實驗都是經(jīng)常采用的。

1 孔英梅，楊伯群.新藥有關(guān)物質(zhì)檢查中的一些問題［J］. 中國新藥雜志，2000，9(7):462

2 中國藥典［S］.二部. 2010:附錄194，附錄204

3 康健磊，徐冰珠，李建宇，等.關(guān)于合成多肽藥物中非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27(5):387

4 王鵬.合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證和質(zhì)量研究［J］. 中國新藥雜志，2009，18(24):2302