■戴 燊 程茂基 韓 信 吳 超 李小燕

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

眾所周知，抗生素的濫用在我國屢禁不止，但是抗生素的大量長期使用會(huì)造成有害菌種的耐藥性及畜產(chǎn)品藥物殘留。食用藥物殘留的畜產(chǎn)品，會(huì)使人類產(chǎn)生過敏反應(yīng)、中毒等危害，并損害身體健康[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，對高品質(zhì)畜產(chǎn)品的不斷追求，開發(fā)安全、綠色、無毒的新型飼料來替代抗生素是當(dāng)前我國養(yǎng)殖業(yè)必須堅(jiān)持的道路，這也成為時(shí)下科研院校單位研究的熱點(diǎn)問題。

自20世紀(jì)80年代開始，人們對于中草藥飼料添加劑的研究熱情不減。大量的試驗(yàn)表明中草藥添加劑不僅能提高生產(chǎn)性能，而且有良好的抗菌作用；中草藥還具毒副作用小、殘留低、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[2]。如山茶籽餅（粕）粉中含有豐富的糖萜素，杜仲葉中含有豐富的綠原酸；黃芪中含有豐富的黃芪多糖；松針粉中含有豐富的松針油；淫羊藿中含有豐富的皂甙；甘草中含有豐富的甘草多糖、甘草酸、甘草黃銅。研究表明，這些皂甙、生物堿、植物甾醇和有機(jī)酸等活性物質(zhì)可以明顯提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫力[3-6]。但是中草藥由于植物細(xì)胞壁的阻礙作用，使得藥性難得到充分釋放，然而，中草藥經(jīng)過微生物發(fā)酵后，由于植物細(xì)胞壁被酶解，大量的活性物質(zhì)溶出，極大程度地提高了有效成分的含量，如吳志勇等[7]將黃芪發(fā)酵，結(jié)果可以大大提高黃芪的療效。雖然中草藥發(fā)酵技術(shù)取得了不少進(jìn)展,但是目前國內(nèi)外少數(shù)一些中草藥產(chǎn)品或研究仍有不足之處:①產(chǎn)品或研究都是單一的有氧發(fā)酵或厭氧發(fā)酵，即要么只有氧發(fā)酵，要么只采用厭氧發(fā)酵，未見有氧和厭氧異步發(fā)酵的報(bào)道或產(chǎn)品；②飼用發(fā)酵與酶解提取中草藥的組方也大多是單一的，缺乏科學(xué)的中草藥復(fù)合組方發(fā)酵產(chǎn)品或研究。③發(fā)酵菌種的合理選擇，菌種混合發(fā)酵相對單一菌種發(fā)酵而言，具有更強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力，選擇合適的發(fā)酵菌種，對生物發(fā)酵的生產(chǎn)具有重要意義。本研究先采用黑曲霉有氧發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶、果膠酶等破解植物細(xì)胞壁，再用植物乳桿菌厭氧發(fā)酵酶解。采用的黑曲霉是經(jīng)過N+注入經(jīng)過選育的高產(chǎn)纖維素酶，、果膠酶、蛋白酶等酶的菌株，植物乳桿菌可產(chǎn)生大量的營養(yǎng)因子，維生素以一些促生長因子。發(fā)酵中草藥由山茶籽餅（粕）粉、黃芪、山楂、甘草、淫羊藿組成的復(fù)方中草藥。通過研究最佳混菌發(fā)酵工藝條件下產(chǎn)纖維素酶活、果膠酶的活力大小，以及通過發(fā)酵前后營養(yǎng)成分的比較，最終為開發(fā)出一種可替代抗生素的綠色、健康、環(huán)保的新型生物飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲益生菌株AN03（N+注入誘變選育的高產(chǎn)酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的菌株）、植物乳桿菌ANCLA01。

1.1.2 中草藥組方

山茶籽餅（粕）粉、黃芪、山楂、松針粉、淫羊藿，購自合肥琥珀中藥店。去雜粉碎過80目篩。

1.1.3 黑曲霉斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基；植物乳桿菌ANCLA01:MRS培養(yǎng)基。

1.1.4 液體種子培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（不加瓊脂）；植物乳桿菌AN?CLA01:MRS培養(yǎng)基（不加瓊脂）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化

在單因素研究水平的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)基。有氧黑曲霉發(fā)酵階段溫度30℃、厭氧植物乳桿菌發(fā)酵階段溫度為37℃，有氧、厭氧發(fā)酵時(shí)間比為2∶1，總發(fā)酵時(shí)間為96 h，接種比例為2%∶2%，pH值為5。研究中草藥濃度，葡萄糖添加量、酵母膏添加量、以及K2HPO4添加量對纖維素酶活、果膠酶活的影響（見表1）。

表1 最佳培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在以上單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定最佳培養(yǎng)基后,設(shè)計(jì)4因素3平水正交試驗(yàn)（見表2），研究有氧厭氧發(fā)酵時(shí)間比、總發(fā)酵時(shí)間、接種比例、pH值對混菌發(fā)酵的影響，以纖維素酶活、果膠酶活為衡量指標(biāo)確定混菌發(fā)酵的最優(yōu)條件。

表2 最佳發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 粗酶液的制取

纖維素酶液的制備：將發(fā)酵液用0.45 μm的濾膜過濾，吸取1 ml酶液于一定體積的容量瓶中，用緩沖溶液定容，測定酶活時(shí)取一定合適的倍數(shù)。

果膠酶液的制備：將發(fā)酵液用0.45 μm的濾膜過濾，吸取1 ml酶液于一定體積的容量瓶中，用緩沖溶液定容，測定酶活時(shí)取一定合適的倍數(shù)。

1.3 測定方法

纖維素酶活測定采用DNS法：在37℃，pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位[8]。

果膠酶活測定采用DNS法：1 g酶液在50℃、pH值為5.0的條件下，1 h分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活單位[9]。

粗蛋白測定采用凱氏定氮法；

粗灰分、鈣磷等營養(yǎng)成分參照張麗英[10]《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》的方法檢測；

中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素測定采用Van Soest法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理與分析使用SAS軟件，進(jìn)行方差分析與多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

由表3的正交試驗(yàn)結(jié)果分析可以看出，影響纖維素酶活、果膠酶活力的四個(gè)因素的主次順序?yàn)椋褐胁菟帩舛龋窘湍父嗵砑恿浚綤2HPO4添加量＞葡萄糖添加量，其中中草藥濃度對兩種酶活的影響有顯著差異（P＜0.05），其他添加量對酶活影響不顯著(P＞0.05)。當(dāng)中草藥濃度過大時(shí)，中草藥液中的物質(zhì)對菌種的產(chǎn)酶有一定的抑制作用。表3可以看出，最佳發(fā)酵濃度為10%。從表3可以看出最優(yōu)組合為A2B1C1D1，即中草藥濃度為10%，葡萄糖添加量為1%，酵母膏添加量為0.2%，K2HPO4添加量為0.1%時(shí)，產(chǎn)纖維素酶活和果膠酶酶活力最高，由于表中并沒有這個(gè)組合,因此對該最優(yōu)水平進(jìn)行分析驗(yàn)證，測得在此條件下纖維素酶活達(dá)到1 398.5 U/ml，果膠酶活達(dá)到1 259.3 U/ml。因此，確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基：中草藥濃度為10%,葡萄糖添加量為1%,酵母膏添加量為0.2%，K2HPO4添加量為0.1%。

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化（見表4）

表4 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

由表4的正交試驗(yàn)結(jié)果分析可以看出，影響纖維素酶活、果膠酶活的四個(gè)因素的主次順序?yàn)楹醚鯀捬鯐r(shí)間比例＞總發(fā)酵時(shí)間＞接種比例＞pH值，其中好氧厭氧時(shí)間比例、總發(fā)酵時(shí)間對兩種酶活的影響差異極顯著（P＜0.01）,接種比例差異顯著（P＜0.05），pH值對產(chǎn)酶的影響不顯著(P＞0.05)。好氧厭氧時(shí)間比例低，好氧時(shí)間短，影響黑曲霉的生長繁殖，因而分泌的酶量較低，好氧厭氧發(fā)酵時(shí)間比例相等時(shí)，黑曲霉的發(fā)酵時(shí)間也相對較短，因而產(chǎn)生的酶量也少?？偘l(fā)酵時(shí)間過長過短對兩種酶活的影響都很大，發(fā)酵時(shí)間過短不利于菌種的生長繁殖，發(fā)酵時(shí)間過長，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，菌種生產(chǎn)環(huán)境惡化，對發(fā)酵也造成不利影響。在此表中，可以看出最優(yōu)發(fā)酵條件組合是A3B2C2D1，即好氧厭氧發(fā)酵時(shí)間比為2∶1，總發(fā)酵時(shí)間為96 h，接種量比例為2%∶2%，pH值為5時(shí)，由于表中沒有此組合，因此對該最優(yōu)水平試驗(yàn)分析，測得此條件下纖維素酶活達(dá)到1 412.3 U/ml,果膠酶活達(dá)到1 287.5 U/ml。由此，確定發(fā)酵條件為：好氧厭氧發(fā)酵時(shí)間比為2∶1，總發(fā)酵時(shí)間為96 h，接種量比例為2%∶2%，pH值為5。

2.3 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分的變化

由表5中試驗(yàn)結(jié)果可知，中草藥經(jīng)混菌發(fā)酵，粗蛋白由發(fā)酵前的11.35%提高到14.89%，提高了31.19%，粗脂肪提高了59.11%，Ca、P含量分別提高了50%、85.71%，中性洗滌纖維，酸性洗滌纖維，木質(zhì)素分別降解了24.21%、12.58%、17.56%。營養(yǎng)價(jià)值有了明顯的提高。

表5 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分對比（%）

3 討論

3.1 微生物的生長繁殖需要適宜的滲透壓環(huán)境，菌體的正常繁殖速率，在通常情況下與底物的培養(yǎng)基的濃度成線性關(guān)系，但是，底物濃度過高，培養(yǎng)基的粘度必然增加，影響到培養(yǎng)基的滲透壓和溶氧，對微生物生長反而不利。而且，培養(yǎng)基過于豐富，有時(shí)會(huì)使菌體生長過盛，發(fā)酵液非常粘稠，使得傳質(zhì)狀況變差，不利于產(chǎn)物的合成[11]。因此.必須選擇合適的底物濃度。本試驗(yàn)中發(fā)酵培養(yǎng)基的最適底物濃度為10%，這與韓春楊[12]的研究報(bào)道一致。

好氧厭氧發(fā)酵時(shí)間過低或者相等時(shí)，好氧黑曲霉沒有足夠的時(shí)間產(chǎn)生足夠量的纖維素酶、果膠酶等，因而合適的好氧厭氧發(fā)酵時(shí)間比例對酶活的產(chǎn)量有極顯著的影響。總發(fā)酵時(shí)間過短不利于菌種的正常生長繁殖；而時(shí)間過長，有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，影響培養(yǎng)基的滲透壓和溶氧，對發(fā)酵反而不利，本試驗(yàn)選用總發(fā)酵時(shí)間為96 h，這與朱平軍的研究報(bào)道一致[13]。

合適的接種比例對產(chǎn)酶量也有顯著的影響，接種量比例不均不利于有益菌的正常繁殖，還可能產(chǎn)生競爭關(guān)系，反而影響產(chǎn)酶量，本試驗(yàn)兩種菌的接種比例為2%∶2%。

pH值是影響菌種正常生長繁殖的因素之一，本實(shí)驗(yàn)的最適產(chǎn)量pH值為5，這可能因?yàn)橐环矫嬖诖藀H值時(shí)，有利于有益菌種的正常繁殖，另一方面抑制了其他雜菌的正常繁殖。

3.2 中草藥經(jīng)混菌發(fā)酵后，其營養(yǎng)價(jià)值有了明顯的提高，尤其是極大的降解了纖維素含量，從而破解了大量的細(xì)胞壁，使得藥物活性更大地釋放出來，提高了中草藥的綜合利用價(jià)值，本試驗(yàn)采用的是經(jīng)過N+注入誘變選育的高產(chǎn)酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的黑曲霉菌株以及植物乳桿菌ANCLA01。此兩種菌種的好氧與厭氧混菌發(fā)酵對酶量的高產(chǎn)有功不可沒的作用。

4 結(jié)論

4.1 本試驗(yàn)先采用黑曲霉有氧發(fā)酵，再用植物乳桿菌厭氧發(fā)酵，生產(chǎn)新型生物中藥，最佳培養(yǎng)基條件為中草藥濃度為10%，葡萄糖添加量為1%,酵母膏添加量為0.2%，K2HPO4添加量為0.1%，有氧發(fā)酵溫度為30℃，厭氧發(fā)酵溫度為37℃，好氧厭氧發(fā)酵時(shí)間比為2∶1，總發(fā)酵時(shí)間為96 h，接種量比例為2%∶2%，pH值為5。在比條件下纖維素酶活達(dá)到1 412.3 U/ml，果膠酶活達(dá)到1 287.5 U/ml。

4.2 中草藥經(jīng)混菌發(fā)酵后，粗蛋白由發(fā)酵前的11.35%提高到14.89%，提高了31.19%，粗脂肪提高了59.11%，Ca、P含量分別提高了50%、85.71%，中性洗滌纖維，酸性洗滌纖維，木質(zhì)素分別降解了24.21%、24 12.58%、17.56%。營養(yǎng)價(jià)值有了明顯的提高。