熊云彪，楊承勇，黃生炫，王 超，楊 恒，司書喜，劉窗溪 (貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州貴陽550002)

急性腦血管病變又稱腦卒中，是一種常見的致死性和致殘性疾病，與心臟病和惡性腫瘤共同構(gòu)成人類三大致死疾病。新近研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)不僅與高血壓形成有關(guān)，而且與急性腦梗死缺血-復(fù)流過程中神經(jīng)元損傷、變性、程序性凋亡的病理發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)［1-3］。近年來的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)對(duì)腦缺血后神經(jīng)元功能的恢復(fù)具有重要的保護(hù)作用［4］。但EPO 對(duì)神經(jīng)元的具體保護(hù)機(jī)制尚未被揭示，有關(guān)腦缺血EPO 干預(yù)后腦組織內(nèi)NPY 含量改變的關(guān)系研究更是甚少。因而，本實(shí)驗(yàn)通過建立兔局灶性腦缺血模型，研究在EPO 干預(yù)下家兔腦缺血損傷不同時(shí)間段NPY 的表達(dá)變化，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)機(jī)制及治療策略的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性新西蘭兔 42 只，體質(zhì)量 2.0 ～2.5 kg，由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為腦缺血組(18 只)、EPO干預(yù)組(18 只)和假手術(shù)組(6 只)，其中腦缺血組和EPO 干預(yù)組又根據(jù)手術(shù)后取材時(shí)間的不同分6 h、12 h、24 h 組。假手術(shù)組于術(shù)后24 h 取材。

1.2 藥品及試劑

重組人紅細(xì)胞生成素注射液(recombinant human erythropoietin，rHuEPO，商品名:環(huán)爾博)，北京四環(huán)生物工程制品廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào):20090406。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制備及處理 采用開顱法［5］制作大腦中動(dòng)脈(MCA)缺血的模型:取新西蘭兔1 只行腹腔注射麻醉。麻醉平穩(wěn)后俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。在手術(shù)顯微鏡下于左眶上緣做切口，依次切開頭皮，在左顳頂骨開取骨窗暴露左側(cè)大腦半球，找到位于嗅束及大腦下靜脈之間的一段大腦中動(dòng)脈(MCA)，將吸有50%FeCl3小片定量濾紙敷在MCA 上，持續(xù)30 min 后去掉濾紙。用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合后，回籠飼養(yǎng)。觀察動(dòng)物有無偏癱癥狀。假手術(shù)組不用FeCl3濾紙覆蓋。EPO 干預(yù)組術(shù)后30 min 予457 IU/kg EPO 腹腔內(nèi)注射。根據(jù)Zea Longa 評(píng)分法選擇成功的動(dòng)物模型。神經(jīng)功能評(píng)分:無神經(jīng)功能缺損癥狀，活動(dòng)正常為0 分;不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1 分;行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈為2 分;向偏癱側(cè)傾倒為3 分;不能自行行走，意識(shí)喪失為4 分。本實(shí)驗(yàn)選取的動(dòng)物模型均為1 ～3 分。成功的動(dòng)物模型分別于術(shù)后 6、12、24 h 取腦缺血組和EPO 干預(yù)組腦組織標(biāo)本，假手術(shù)組于術(shù)后24 h 取腦組織，多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 mm 厚的連續(xù)切片，每例每個(gè)觀察指標(biāo)均觀察3 張切片以上。

1.3.2 染色方法 HE 染色按常規(guī)操作步驟進(jìn)行;免疫組織化學(xué)SABC 法染色，顯示NPY 陽性細(xì)胞。主要步驟為:切片常規(guī)化蠟至水，10%H2O210 min，正常山羊血清(1︰50)封閉20 min，滴加 NPY 抗血清(1︰1 000)(SIGMA 公司提供)，4 ℃ 過夜，羊抗兔 IgG(1︰100)37 ℃ 孵育 20 min，SABC 復(fù)合物(1︰100)37 ℃孵育 20 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。方法對(duì)照:PBS 緩沖液代替特異性抗血清，余步驟同上。

1.3.3 圖像分析 隨機(jī)選取假手術(shù)組、腦缺血和EPO 干預(yù)組腦組織切片各5 張，在40 倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)有核NPY 陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 11.5 軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。P ＜0.05 差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色光鏡觀察

假手術(shù)組:大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富、均勻，核圓形或類圓形，核仁明顯(圖1a)

腦缺血組:多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不完整，胞漿內(nèi)尼氏體分解，核漿分界不清，細(xì)胞核固縮，染色較深，核仁不清，細(xì)胞周圍中重度水腫(圖1b)。

EPO 干預(yù)組:部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠完整、尼氏體分解，細(xì)胞核固縮，部分核漿分界及細(xì)胞核尚可辨認(rèn)，核仁不清，細(xì)胞周圍中度水腫 (圖1c)。

2.2 免疫組織化學(xué)SABC 法光鏡觀察

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組大腦皮質(zhì)NPY 陽性細(xì)胞數(shù)量較少，棕黃色的陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)在胞質(zhì)內(nèi)(圖2a)。方法對(duì)照切片未見陽性反應(yīng)細(xì)胞。缺血后6 h，腦缺血組、EPO 干預(yù)組缺血側(cè)皮質(zhì)NPY 陽性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組增多(圖2b);腦缺血組、EPO 干預(yù)組NPY 陽性細(xì)胞數(shù)量隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)顯著增多，免疫染色較深。與腦缺血組相比，EPO干預(yù)組 NPY 陽性細(xì)胞數(shù)量于缺血后 12、24 h 有所下降(圖2c ～f)，但均多于假手術(shù)組。

2.3 圖像分析

圖1 家兔腦皮質(zhì)區(qū) HE 染色(×400)

腦缺血6 h 后，單純腦缺血與EPO 干預(yù)家兔大腦皮質(zhì)NPY陽性細(xì)胞數(shù)量與假手術(shù)組相比均有所增多(P ＜0.05)，且隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，陽性細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)(P ＜0.05)。腦缺血12 h 后，EPO 干預(yù)組NPY 陽性細(xì)胞數(shù)量較腦缺血組有所減少(P ＜ 0.05)，缺血 24 h 后 2 組細(xì)胞數(shù)量變化更加明顯(P ＜0.01)，見表1。

表1 大腦皮質(zhì)NPY 有核陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

表1 大腦皮質(zhì)NPY 有核陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

* :與假手術(shù)組 6 h、腦缺血組 6 h、EPO 干預(yù)組 6 h 比較，P ＜0.05;#:與腦缺血組 12 h、EPO 干預(yù)組 12 h 比較，P ＜0.05;△:與腦缺血組 12 h 比較，P ＜0.05;▲:與腦缺血組 24 h 比較，P ＜0.01

組別 n 6 h 12 h 24 h假手術(shù)組6 0 0 3.16 ±1.73腦缺血組 18 8.81 ±1.02 15.70 ±1.25* 19.31 ±1.61＊△EPO 干預(yù)組 18 7.84 ±1.31 11.24 ±2.46＊△ 13.02 ±4.35* #▲

3 討論

NPY 由36 個(gè)氨基酸組成，屬胰多肽家族，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周器官，具有廣泛的生物學(xué)活性。研究顯示NPY 對(duì)腦血管有較強(qiáng)的收縮作用，在體內(nèi)的縮血管效應(yīng)可使局部腦血流減少50%［6］。老年短暫性腦缺血發(fā)作患者血清NPY 水平顯著高于正常人［7］。Yu 等［8］對(duì) 450 例腦缺血中風(fēng)患者 NPY 基因分析表明在NPY 啟動(dòng)子區(qū)域C 端等位基因-399 T/C 多態(tài)現(xiàn)象對(duì)于缺血性發(fā)作是一種獨(dú)立的危險(xiǎn)因子，提示NPY 可能參與腦中風(fēng)的病理學(xué)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過建立家兔大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血模型，研究缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)腦組織內(nèi)NPY 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)，NPY 表達(dá)逐漸增高。這與上述學(xué)者的研究結(jié)果類似。推測(cè)是由于腦缺血缺氧，交感-兒茶酚胺系統(tǒng)興奮，使副交感神經(jīng)釋放NPY 增加。增多的NPY 可能通過以下途徑參與缺血性腦損傷的病理過程:①不斷刺激血管收縮，進(jìn)一步降低腦血流，加重缺血性腦損傷;②通過激活神經(jīng)元型一氧化氮合酶(NOS)產(chǎn)生NO增多 ，加重缺血半暗帶區(qū)的代謝紊亂［9］。

圖2 家兔腦皮質(zhì)區(qū)NPY 陽性細(xì)胞 (SABC 法×400)

EPO 是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白，是一種造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要用于治療多種原因所致的貧血，在調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的過程中起著重要作用。EPO 及其受體在人類和嚙齒類動(dòng)物腦組織中廣泛表達(dá)，通過自分泌或旁分泌方式對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用。近年來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)研究均證實(shí)EPO對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用［10-11］。本實(shí)驗(yàn)中，腦缺血組家兔缺血側(cè)皮質(zhì)多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，形態(tài)不完整，胞漿內(nèi)尼氏體分解，核漿分界不清，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞周圍中重度水腫，EPO 干預(yù)后，腦組織水腫減輕，變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少。這些結(jié)果表明EPO 可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并能減輕腦組織水腫，與上述研究結(jié)果一致。

結(jié)果顯示EPO 治療后家兔缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)NPY 表達(dá)有所降低，提示EPO 對(duì)缺血缺氧腦組織的保護(hù)作用可能與NPY 的表達(dá)有關(guān)。關(guān)于EPO 神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制目前尚不清楚，秦川等［12］研究表明EPO 預(yù)處理在心肌H/R 損傷中具有顯著的抗氧化作用。有研究顯示EPO 可使神經(jīng)元內(nèi)誘導(dǎo)型NOS 水平降低，并通過抑制NO 介導(dǎo)的自由基產(chǎn)生或拮抗其毒性，從而發(fā)揮抗氧化作用。NPY 則通過激活NOS 使NO 增多，加重腦缺血損傷。但EPO 是否通過調(diào)節(jié)NO 這一途徑間接調(diào)節(jié)NPY 的含量還需進(jìn)一步深入研究。有關(guān)EPO與 NPY 的關(guān)系研究甚少，Kondo 等［13］研究癲癇發(fā)作模型大鼠EPO 的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)無論是內(nèi)源性還是外源性EPO 均可以調(diào)節(jié)癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度并保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元，其可能機(jī)制包括阻斷海馬區(qū)致癲癇細(xì)胞的形成和調(diào)節(jié) NPY 的釋放。Gebhard 等［14］研究證實(shí)暴露于CO 中的去腎神經(jīng)大鼠其EPO 分泌顯著增高，且增高效應(yīng)能被NPY 阻斷。提示在CO 暴露情況下，與腎神經(jīng)相關(guān)的EPO 分泌增多的反應(yīng)可能通過NPY 受體途徑。因此我們推測(cè)，腦缺血后EPO 調(diào)節(jié)NPY 的釋放可能是其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。

［1］Duszczyk M，Ziembowicz A，Gadamski R，et al.Changes in the NPY immunoreactivity in gerbil hippocampus after hypoxic and ischemic precon ditioning［J］.Neuropeptides，2009，43(1):31 -39.

［2］楊海林，孫樹林，徐淑珍.74 例缺血性腦血管病診斷治療分析［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2007，16(3):184.

［3］Smia?owska M，Domin H，Zieba B，et al.Neuroprotective effects of neuropeptide Y-Y2 and Y5 receptor agonists in vitro and in vivo［J］.Neuropeptides，2009，43(3):235 -249.

［4］Chatagner A，Hüppi PS，Ha-Vinh Leuchter R，et al.Erythropoietin and neuroprotection ［J］.Arch Pediatr，2010，17 (S3):78 -84.

［5］劉 健，李 祥，李健龍，等.氯化鐵致兔大腦中動(dòng)脈腦缺血模型的建立［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2001，(4):382.

［6］Sperk G，Hamilton T，Colmers WF.Neuropeptide Y in the dentate gyrus［J］.Prog Brain Res，2007，163:285 -297.

［7］王 英，周武娟.老年短暫性腦缺血發(fā)作與hs-CRP 和NPY 關(guān)系的探討［J］.放射免疫學(xué)雜志，2011，24(1):31 -32.

［8］Yu JT，Yu NN，Gao SS，et al.Neuropeptide Y polymorphisms and ischemic stroke in Chinese population ［J］.Clin Chim Acta，2010，411(3 -4):242 -245.

［9］譚 峰，顧 衛(wèi)，萬賽英，等.環(huán)維黃楊星D 對(duì)高血壓大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)肽mRNA 表達(dá)的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志［J］.2008，10(11):852 -855.

［10］Jerndal M，F(xiàn)orsberg K，Sena ES，et al.A systematic review and meta-analysis of erythropoietin in experimental stroke［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30(5):961 -968.

［11］史志勤，王維平，于江華，等.重組人紅細(xì)胞生成素對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬p2Akt 和XIAP 的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(1):1453 -1457.

［12］秦 川，肖穎彬，陳 林，等.促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理在大鼠心肌缺氧復(fù)氧損傷中的抗氧化效應(yīng)［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2011，20(1):71 -73.

［13］Kondo A，Shingo T，Yasuhara T，et al.Erythropoietin exerts anti-epileptic effects with the suppression of aberrant new cell formation in the dentate gyrus and upregulation of neuropeptide Y in seizure model of rats［J］.Brain Res，2009，1296:127 -136.

［14］Gebhard C，Petroktistis F，Zhang H，et al.Role of renal nerves and salt intake on erythropoietin secretion in rats following carbon monoxide exposure［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，319(1):111 -116.