吳麗珍，雷 艷，杜興華，3，蔡 穎，董兆君 (1.云南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院功能科，云南 昆明 6504;.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所，重慶400038;3.云南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，云南昆明6504)

氰化物用途廣泛，既是化工原料，也是典型的速殺性化學(xué)戰(zhàn)劑。氰化物進(jìn)入體內(nèi)，迅速細(xì)胞色素氧化酶中的Fe3+結(jié)合，使呼吸鏈的電子傳遞無法進(jìn)行，最終導(dǎo)致組織缺氧［1-3］。4-二甲氨基吡啶(4-DMAP)是一種高鐵血紅蛋白形成劑，是第二代抗氰藥物，可解除氰離子對細(xì)胞色素氧化酶的抑制作用［4］。肝臟及腎臟是人體的重要器官，氰中毒和低溫暴露均可引起肝腎功能的嚴(yán)重?fù)p傷。若在低溫暴露下遭受氰中毒，肝腎功能可能發(fā)生的變化及防護(hù)措施均未見相關(guān)報道。本實驗采用低溫暴露復(fù)合氰中毒的動物模型，觀察低溫和氰中毒兩種因素對家兔血液中肝腎功能指標(biāo)的影響及4-DMAP 對致傷作用的改善效果，初步探討低溫環(huán)境下氰中毒時肝臟及腎臟的致傷機(jī)制及防護(hù)措施。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

普通級日本大耳白兔30 只，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量(2.0 ±0.2)kg，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為 6 組，即 A 組(20 ℃ 組)、B 組(2 ℃ 組)、C 組(-20 ℃組)、D 組(2 ℃氰中毒組)、E 組(-20 ℃氰中毒組)、F 組(2 ℃氰中毒治療組)，每組各5 只。

1.2 試劑和儀器

氰化鈉(NaCN)購自美國 Fluka 公司，純度大于98%，4-DMAP由本室合成，臨用前新鮮配制，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。日立7020 型全自動生化分析儀為HITACHI 公司產(chǎn)品，檢測試劑盒購自四川邁克生物科技公司。

1.3 實驗方法

動物采用戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上。采用與我們前期實驗相同的方法進(jìn)行頸總動脈插管［5］。插管成功后，20 ℃組置于普通實驗室內(nèi)，室溫控制在20 ℃;低溫組置于冰柜中，溫度分別控制在2 ℃、-20 ℃;中毒組于置冰柜后60 min 時一次腹腔性注射NaCN 2.0 mg/kg;治療組于置冰柜后60 min 時腹腔注射NaCN 2.0 mg/kg，同時肌肉注射4-DMAP 3.2 mg/kg。各組自置于實驗溫度后開始計時，于 0、30、60、90、120 min 時間點抽取動脈血 5 mL，離心分離血漿(4 ℃，2 000 r/min，離心 10 min)，-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.4 檢測指標(biāo)

肝功能檢測指標(biāo)包括冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、L-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(L-glutamyl transferase，GGT)，腎功能檢測指標(biāo)包括BU、肌酐(creatinine，CREA)、尿酸(uric acid，UA)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肝功能指標(biāo)的變化

2.1.1 AST 的變化 與同時相 A 組比較，B、C、D、E 組的AST 含量均呈升高趨勢(P ＜ 0.05)。在致傷 90 min 后，F(xiàn) 組的AST 水平顯著低于未經(jīng)干預(yù)的 D 組(P ＜0.05)，但仍高于 A 組的正常水平(P ＜0.05)。隨著低溫暴露強(qiáng)度增強(qiáng)和(或)低溫復(fù)合氰中毒時間的延長，AST 的變化趨勢逐漸增強(qiáng)，且出現(xiàn)顯著性變化的時間有所提前，C 組于低溫作用30 min 時出現(xiàn)AST增高，B 組于低溫作用60 min 時出現(xiàn)AST 增高，E 組在120 min時AST 升高尤為顯著。各組的AST 檢測結(jié)果見表1。

2.1.2 ALT 的變化 C、E 組與同時相點 A 組比較，ALT 含量呈升高趨勢，在90、120 min 時尤為顯著(P ＜0.05)。致傷90 min 后，F(xiàn) 組 ALT 含量顯著低于未經(jīng)干預(yù)的 D 組(P ＜0.05)，與A 組水平接近。隨著致傷時間的延長，B、C、D、E 組 ALT 含量逐漸增高(P ＜0.05)。各組的ALT 檢測結(jié)果見表2。

2.1.3 ALP 的變化 A、B、C、D、E、F 組在 0 min 時的 ALP含量分別為(136.20 ± 7.56)、(165.20 ± 52.22)、(135.00 ±16.90)、(123.4 ± 5.94)、(178.80 ± 6.26)、(159.00 ± 40.45)U/L，在 120 min 時的 ALP 含量分別為 (112.20 ± 12.76)、(254.00 ± 44.13)、(125.80 ± 20.45)、(130.40 ± 13.79)、(177.40 ±17.64)、(154.40 ± 26.52)U/L。B、C、D、E、F 組的ALP 含量均明顯高于同時相點 A 組(P ＜0.05)。B 組的 ALP含量在 120 min 時明顯高于 0 min 時(P ＜0.05)，其余各組 ALP含量未隨時間出現(xiàn)明顯變化。

2.1.4 GGT 的變化 A、B、C、D、E、F 組在 0 min 時的 GGT含量分別為(8.20 ± 0.84)、(6.00 ± 1.87)、(5.80 ± 1.48)、(6.40 ±1.95)、(8.40 ± 3.85)、(5.20 ± 3.35)U/L，在 120 min時的 GGT 含量分別為(6.60 ±2.07)、(5.80 ± 1.92)、(7.00 ±1.22)、(4.80 ±1.30)、(9.00 ± 4.47)、(4.60 ± 2.61)U/L。各組在相同時相點的GGT 含量無顯著差異(P ＞0.05)，且隨著作用時間的延長，各組GGT 含量也未出現(xiàn)明顯變化(P ＞0.05)。

2.2 腎功能指標(biāo)的變化

2.2.1 BU 的變化 B、C、D、E 組的 BU 含量均明顯高于同時相的A 組(P ＜0.05)，且隨著時間的延長呈逐漸升高趨勢(P ＜0.05)。F 組的 BU 含量顯著低于未經(jīng)干預(yù)的 D 組(P ＜0.05)。各組的 BU 檢測結(jié)果見表3。

2.2.2 CREA 的變化 B、C、D、E 組的 CREA 含量較 A 組相同時相點明顯升高(P ＜0.05)，且隨著致傷時間的延長呈逐漸升高趨勢，E 組在120 min 時升高尤為明顯。F 組的 CREA 含量顯著低于未經(jīng)干預(yù)的D 組(P ＜0.05)。各組的CREA 檢測結(jié)果見表4。

2.2.3 UA 的變化 B、C 組與 A 組同時相點的 UA 含量無顯著性差異，D、E 組的 UA 含量在致傷 90、120 min 時顯著升高，且明顯高于A 組(P ＜0.05)。各組的UA 檢測結(jié)果見表5。

表1 各組血漿AST 含量變化(±s，n=5，U/L)

表1 各組血漿AST 含量變化(±s，n=5，U/L)

a:與同組0 min 時比較，P ＜0.05;b:與同時相 A 組比較，P ＜0.05;c:與同組 60 min 時比較，P ＜0.05;d:與同時相 D 組比較，P ＜0.05

組別0 min 30 min 60 min 90 min 120 min A 組 16.00 ±3.67 15.20 ± 5.63 17.00 ±3.08 15.40 ±4.8821.80 ± 12.74 B 組 29.60 ±8.02 29.40 ± 6.07b 33.20 ±4.32ab 36.00 ±6.44ab 43.20 ± 3.56ab C 組 15.80 ±3.56 18.60 ± 3.21ab 23.20 ±4.76ab 27.60 ±10.85ab 37.20 ± 12.30ab D 組 21.00 ±5.70 21.00 ± 5.70b 25.00 ±6.20ab 28.20 ±7.98ab 33.60 ± 7.27ab E 組 24.00 ±13.29 27.20 ± 15.48ab 35.80 ±18.01ab 57.60 ±20.16abd 273.40 ± 84.90abd F 組 30.60 ±19.88 29.80 ± 19.32b 29.06 ±8.92b 31.20 ±16.89bd 25.00 ± 17.64abcd

表2 各組血漿ALT 含量變化(±s，n=5，U/L)

表2 各組血漿ALT 含量變化(±s，n=5，U/L)

a:與同組0 min 時比較，P ＜0.05;b:與同時相 A 組比較，P ＜0.05;c:與同組 60 min 時比較，P ＜0.05;d:與同時相 D 組比較，P ＜0.05

組別0 min 30 min 60 min 90 min 120 min A 組 41.60 ±7.99 41.64 ±12.14 42.80 ±9.26 38.00 ±9.63 37.60 ±7.23 B 組 28.80 ±10.62 29.80 ±8.04 30.00 ±6.08a 34.40 ±7.20a 35.60 ± 5.27a C 組 42.80 ±15.29 43.80 ±18.82b 46.60 ±19.77ab 48.80 ±22.98ab 53.20 ± 21.63ab D 組 29.00 ±7.07 29.80 ±9.09 32.80 ±7.19a 34.20 ±10.06a 36.40 ± 10.64a E 組 44.20 ±10.69 44.00 ±6.20b 49.20 ±7.73ab 51.80 ±19.64abd 67.00 ± 11.81abd F 組 27.40 ±5.59 28.80 ±2.05 31.40 ±3.88a 29.20 ±0.84acd 19.80 ± 1.30acd

表3 各組血漿BU 含量變化(±s，n=5，U/L)

表3 各組血漿BU 含量變化(±s，n=5，U/L)

a:與同組0 min 時比較，P ＜0.05;b:與同時相 A 組比較，P ＜0.05;c:與同組 60 min 時比較，P ＜0.05;d:與同時相 D 組比較，P ＜0.05

組別0 min 30 min 60 min 90 min 120 min A 組 8.00 ± 1.85 8.10 ±0.80 7.64 ±0.78 7.58 ±0.62 7.48 ± 0.37 B 組 8.80 ± 0.46 8.94 ±0.43 9.50 ±1.16ab 10.12 ±1.15ab 10.84 ± 1.39ab C 組 7.10 ± 0.52 7.00 ±0.62 7.86 ±0.70 9.34 ±1.50ab 10.58 ± 2.06ab D 組 7.78 ± 1.02 8.04 ±0.95 8.62 ±0.88ab 10.22 ±1.06ab 10.88 ± 1.18ab E 組 6.42 ± 1.36 6.58 ±1.58 7.68 ±0.67a 9.36 ±2.25ab 11.68 ± 3.24ab F 組 7.30 ± 0.28 7.44 ±0.38 8.18 ±0.98ab 7.64 ±0.58cd 7.18 ± 0.29cd

表4 各組血漿 CREA 含量變化(±s，n=5，U/L)

表4 各組血漿 CREA 含量變化(±s，n=5，U/L)

a:與同組0 min 時比較，P ＜0.05;b:與同時相 A 組比較，P ＜0.05;c:與同組 60 min 時比較，P ＜0.05;d:與同時相 D 組比較，P ＜0.05

組別0 min 30 min 60 min 90 min 120 min A 組 46.80 ± 12.13 45.40 ±15.40 49.40 ±14.94 52.40 ±19.35 58.20 ±19.97 B 組 56.00 ± 12.31 56.40 ±12.66b 57.60 ±16.16b 61.40 ±18.51ab 67.40 ± 22.60ab C 組 62.80 ± 16.48 64.20 ±14.65b 71.20 ±15.80ab 79.60 ±16.18ab 87.20 ± 22.64ab D 組 51.00 ± 9.72 51.80 ±8.04b 56.40 ±8.91ab 62.60 ±13.76ab 68.60 ± 15.81ab E 組 43.20 ± 3.70 46.80 ±5.45b 57.00 ±5.57ab 77.80 ±12.45abd 103.20 ± 20.91abd F 組 32.00 ± 1.87 34.60 ±1.82b 42.60 ±2.70ab 39.00 ±1.87cd 36.60 ± 8.91cd

表5 各組血漿 UA 含量變化(±s，n=5，U/L)

表5 各組血漿 UA 含量變化(±s，n=5，U/L)

a:與同組 0 min 時比較，P ＜0.05;b:與同時相 A 組比較，P ＜0.05

組別0 min 30 min 60 min 90 min 120 min A 組 9.00 ± 4.85 8.80 ±3.77 6.60 ±3.21 5.40 ±4.61 11.20 ± 7.33 B 組 12.80 ± 3.03 8.00 ±3.61 7.20 ±1.64 6.80 ±2.68b 8.00 ± 2.74 C 組 10.40 ± 4.67 8.00 ±4.42 6.60 ±4.16 6.00 ±2.35b 9.40 ± 4.77 D 組 7.00 ± 1.58 6.80 ±3.03 6.60 ±2.30 17.00 ±5.79ab 21.20 ± 11.32ab E 組 6.20 ± 2.59 6.80 ±5.76 6.80 ±3.77 78.00 ±51.42ab 132.00 ± 76.17ab F 組 8.80 ± 2.17 7.00 ±2.45 6.40 ±0.89 21.20 ±10.50ab 20.80 ± 10.55ab

3 討論

寒冷是一種外界環(huán)境因素，寒冷應(yīng)激對細(xì)胞代謝及生長過程有著顯著的影響，最終可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞壞死或凋亡［6］。寒冷應(yīng)激可引起肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及某些哺乳動物細(xì)胞的凋亡［7-8］。寒冷應(yīng)激引起的肝臟內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中，線粒體形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，大量線粒體表現(xiàn)為短小型，線粒體膜電位同時顯著降低［7］。相關(guān)的文獻(xiàn)報道，在寒冷造成的腦損傷中，脂質(zhì)過氧化和胞內(nèi)Ca2+超載可能是加速神經(jīng)元凋亡的重要因素［9］。細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)升高是寒冷應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡時出現(xiàn)的重要細(xì)胞學(xué)現(xiàn)象，同時ROS 增多也反映出線粒體功能受到損傷。目前的研究發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境造成細(xì)胞損傷的機(jī)制主要分兩種:在非凍結(jié)性損傷時，低溫主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此凋亡細(xì)胞普遍存在于整個寒冷應(yīng)激損傷過程中［8］;凍結(jié)性損傷則主要造成細(xì)胞生物膜的物理和化學(xué)損傷，包括膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)異常、膜生理功能紊亂等，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

NaCN 中毒時，氰根離子在體內(nèi)能很快與氧化型細(xì)胞色素氧化酶的三價鐵結(jié)合為氰化高鐵細(xì)胞色素氧化酶，使之不能還原成還原型細(xì)胞色素氧化酶，從而影響介質(zhì)的代謝，使Ca2+濃度明顯增高，膜酯的過氧化作用顯著增強(qiáng)，最終導(dǎo)致抗氧化防護(hù)系統(tǒng)破壞，氧化磷酸化受阻，組織不能利用氧，呈現(xiàn)中毒性缺氧功能改變。組織發(fā)生缺氧，細(xì)胞將從有氧代謝轉(zhuǎn)為無氧酵解，后者產(chǎn)生ATP 的能力明顯低于前者。由于組織供氧減少，利用氧障礙，導(dǎo)致細(xì)胞代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，從而引起細(xì)胞凋亡。

眾多的研究結(jié)果顯示，寒冷應(yīng)激可導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體H2O2產(chǎn)生增多，出現(xiàn)氧化應(yīng)激［10］。寒冷暴露時誘發(fā)的氧化應(yīng)激是造成機(jī)體組織、細(xì)胞損傷的主要因素，并且和細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。而氰中毒亦可對氧化應(yīng)激水平產(chǎn)生顯著影響［1］。機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時，氧自由基大量產(chǎn)生并堆積，可造成肝腎細(xì)胞的細(xì)胞膜、線粒體和其他細(xì)胞器的損害，受損細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)酶釋放入血，從而導(dǎo)致某些血清酶的升高。NaCN 中毒時，組織器官缺血缺氧，無氧酵解引起大量酸性產(chǎn)物堆積，細(xì)胞內(nèi)pH 值降低，細(xì)胞鈉泵功能下降，鈣離子通透性增加，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度增高，從而造成線粒體水腫，線粒體內(nèi)酶釋放入細(xì)胞質(zhì)，使細(xì)胞膜的通透性增加，加速細(xì)胞內(nèi)酶釋放入血，故表現(xiàn)出多項血清酶學(xué)檢測指標(biāo)的顯著升高。

目前，國內(nèi)外關(guān)于低溫或者氰中毒的研究報道較多，而關(guān)于低溫暴露合并氰中毒對機(jī)體影響的文獻(xiàn)尚不多見。本研究將低溫暴露和氰化鈉中毒兩種致傷因素相結(jié)合，通過觀察血液中相關(guān)酶含量的變化，探討低溫復(fù)合氰中毒對肝腎功能的影響。在反應(yīng)肝臟功能的酶類指標(biāo)中，ALT 在肝臟中含量最高，且ALT 僅存在于細(xì)胞漿內(nèi)，肝內(nèi)酶活性比血清高約100 倍，只要有1%的肝細(xì)胞壞死，即可使血清酶活性升高1 倍，是最敏感的肝功能指標(biāo)之一，任何肝細(xì)胞損傷、包膜通透性增加和細(xì)胞壞死都將導(dǎo)致血清中ALT 的活性升高。AST 主要存在于肝細(xì)胞的線粒體及細(xì)胞漿內(nèi)，也可見于心肌、骨骼肌、腎、腦組織中。當(dāng)肝細(xì)胞受損時，血清中AST 的活性也會有所升高。臨床實踐證實，ALT、AST 同時升高，常提示肝損傷的存在。BU、CREA、UA是反映腎臟功能的最敏感的三項指標(biāo)，也是目前臨床上最常使用的衡量腎臟功能的血液生化指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫暴露和低溫復(fù)合氰中毒時，血清AST、ALT、BU、CREA、UA 含量均有明顯升高，尤以復(fù)合損傷時升高更為突出，且致傷時間越長，變化越明顯。4-DMAP是一種高鐵血紅蛋白形成劑，它能使紅細(xì)胞中的血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白(methemoglobin，MHb)，后者可與CN-結(jié)合形成較穩(wěn)定的MHb·CN，從而解除氰化物中毒癥狀。本研究中，治療組給予4-DMAP 干預(yù)后，反映肝腎功能的血液指標(biāo)較復(fù)合傷組均有明顯改善，說明4-DMAP 可有效對抗氰化物的毒性作用。

本實驗結(jié)果提示，低溫暴露復(fù)合氰化鈉中毒時，機(jī)體肝腎功能將會遭受嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)出肝血清酶含量及腎功能指標(biāo)不同程度的改變。低溫暴露復(fù)合氰化物中毒的致傷機(jī)制可能為氧化應(yīng)激反應(yīng)及中毒性缺氧引起的細(xì)胞形態(tài)及功能的損傷，兩種致傷因素的作用不是簡單的相加，而是一種聯(lián)合作用。本研究中，低溫暴露和低溫復(fù)合氰中毒對ALP、GGT 的含量的影響不大，可能是因為ALP、GGT 是主要反應(yīng)膽汁淤積狀況的生化指酶，而上述致傷因素未造成明顯的膽汁淤積癥狀。

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