范月超，顏丙超，陳洪福，紀(jì)建永，張 慧，梅鵬金

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院顱底腫瘤外科，江蘇徐州221006）

垂體瘤是一種顱內(nèi)常見(jiàn)的良性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的15%～20%［1］。高遷移率族蛋白A2（high-mobility-group A2，HMGA2）是非組蛋白染色體蛋白，屬于高遷移率族 A（high-mobility-group A，HMGA）家族，在垂體瘤組織及體外培養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)［2-3］。HMGA2過(guò)表達(dá)是許多良性和惡性腫瘤的標(biāo)志，是一個(gè)預(yù)后不良的指標(biāo)。原代培養(yǎng)的人垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞，在性質(zhì)和特點(diǎn)上更接近于腫瘤在人體的原始狀態(tài)，因此，其在生物治療或?qū)嶒?yàn)中的效果和作用更接近于體內(nèi)腫瘤細(xì)胞對(duì)生物試劑的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用HMGA2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞，觀察HMGA2蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)人垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞增殖及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HMGA2質(zhì)粒（pIRES2-dsRed-HMGA2cDNA）、空載體（pcDNA3.1）（上海艾博斯公司合成），DMEM高糖培養(yǎng)基（Thermo公司），胎牛血清（杭州四季青公司），0.25%胰酶（碧云天公司），羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）（Gibco公司），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司），HMGA2一抗（Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG（北京中杉金橋）。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（日本同仁公司），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（南京凱基公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為：轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pIRES2-dsRed-HMGA2cDNA質(zhì)粒）和空載體組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 原代垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞的培養(yǎng)采用機(jī)械分離法［1］分離垂體瘤細(xì)胞：手術(shù)切除的垂體腺瘤組織在無(wú)菌操作下放入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中立即送往實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌PBS沖洗2次去除結(jié)締組織、壞死組織及血塊，將標(biāo)本用眼科剪剪碎成1mm3大小組織塊加5倍量的0.25%胰酶（預(yù)熱至37℃），在37℃條件下消化30min，每隔5min用吸管吹打分散1次，待細(xì)胞分散良好以后加入5倍量的細(xì)胞培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）（內(nèi)含105U／L青霉素，0.1g／L鏈霉素，2.2g／L NaHCO3，2.0g／L HEPES，10% 胎牛血清）終止消化5min，經(jīng)100目細(xì)胞濾器過(guò)濾后，1 000r／min離心10min棄上清液加入DMEM培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸并分散，成功獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)垂體瘤細(xì)胞株后，DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）、37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，以第3代原代培養(yǎng)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 pIRES2-dsRed-HMGA2cDNA質(zhì)粒由上海艾博斯生物科技有限公司合成并測(cè)序，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于60mm小皿中，待細(xì)胞處于70%～90%融合時(shí)，pIRES2-dsRed-HMGA2cDNA質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染，并嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 免疫印跡法（Western blot）檢測(cè) HMGA2蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染24h后收集兩組細(xì)胞，加入細(xì)胞組織快速裂解液RIPA置于冰上裂解，4℃、15 000g／min離心15min，收取上清液即總蛋白；加入5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸變性5min；通過(guò)10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上加入一抗兔抗人HMGA2及兔抗人β-actin抗體（1∶500），4℃孵育過(guò)夜；復(fù)溫30min，洗滌緩沖液（washing buffer）洗滌 5min，3次，加入稀釋的二 抗 （1∶1 000），室溫下孵育2h；然后四唑硝基藍(lán)（BCIP）和堿性磷酸酶顯色試劑（NBT）顯色。用Image J軟件檢測(cè)各條帶灰度值，計(jì)算HMGA2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（cell counting kit-8，CCK-8）法［4-6］檢測(cè)轉(zhuǎn)染組及空載體組垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞增殖情況 0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染組及空載體組垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞，96孔板每孔鋪3 000個(gè)細(xì)胞、每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔加DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）100μL，四周加磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）液體防止水分蒸發(fā)；置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96h；每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)基100μL，CCK-8溶液10μL，空白對(duì)照孔只加等量無(wú)血清培養(yǎng)基和CCK-8溶液，混勻兩種液體，避光操作；放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5、1、2、4h；酶標(biāo)儀檢測(cè)在450nm波長(zhǎng)下的光密度（optical density，OD）值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染組及空載體組垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞周期變化 0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染組及空載體組垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞后離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1次（2 000r／min離心5min）收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL；然后用70%乙醇4℃固定過(guò)夜；次日，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2遍，小心吸出上清液，可以殘留約50μL左右的PBS，避免吸走細(xì)胞，輕輕彈擊離心管底適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)；加100μL核糖核酸酶 A（ribonuclease A，RNaseA）（20μg／mL）37℃水浴30min；再加入400μL碘化丙啶 （propidium iodide，PI）（50μg／mL）染 色 混 勻，4 ℃ 避 光30min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)［7-8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測(cè)HMGA2蛋白的表達(dá)情況 使用Image J軟件測(cè)定兩組蛋白條帶的灰度值。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組HMGA2蛋白表達(dá)較空載體組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明HMGA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖1。

2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)中在24、48、72、96h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD值均較空載體組細(xì)胞OD值大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染HMGA2質(zhì)粒后細(xì)胞增殖能力較空載體組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 Western blot分析兩組HMGA2蛋白的表達(dá)情況

圖2 垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞周期變化結(jié)果與空載體組相比，轉(zhuǎn)染組垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化，G0／G1期細(xì)胞所占比例減少，S期細(xì)胞所占比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組細(xì)胞G2期細(xì)胞所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞周期的影響（±s，%，n＝3）

表1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞周期的影響（±s，%，n＝3）

組別細(xì)胞周期分布G0／G1 S G2 69.61±0.51 22.49±0.59 14.25±1.51轉(zhuǎn)染組 41.20±1.32 42.63±1.01 15.44±1.00 P＜0.05 ＜0.05 ＞0.05空載體組

3 討 論

HMGA2屬于高遷移率族家族HMGAs。該家族的成員還包括HMGA1a、HMGA1b和HMGA1c，它們均含有3個(gè)N端“AT-鉤”基序，通過(guò)這一結(jié)構(gòu)可以優(yōu)先地結(jié)合B型DNA中富含AT的序列，進(jìn)而誘導(dǎo)構(gòu)象變化促進(jìn)增強(qiáng)子中轉(zhuǎn)錄因子復(fù)原。HMGA2蛋白參與許多生物不同生理過(guò)程，如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、胚胎發(fā)生、分化、致瘤性轉(zhuǎn)化以及病毒基因組的整合和表達(dá)［9］。

由于HMGA2編碼基因位于許多腫瘤細(xì)胞染色體斷裂點(diǎn)的簇集區(qū)，所以它的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)。HMGA1和HMGA2的高水平表達(dá)與腫瘤高度惡性表現(xiàn)型、轉(zhuǎn)移和低生存率有關(guān)，因此是一個(gè)不良預(yù)后指標(biāo)［10］。最近研究證實(shí) HMGA2與多種上皮源性惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)和分化密切相關(guān)［11］，如甲狀腺癌、乳腺癌、口腔鱗癌及非小細(xì)胞肺癌。Piscuoglio等［12］發(fā)現(xiàn)在正常胰腺組織、胰腺上皮內(nèi)瘤變和侵襲性胰腺癌中HMGA1和HMGA2的平均表達(dá)量逐漸增加，與腫瘤的惡性級(jí)別及進(jìn)展呈正相關(guān)，并與新生物的分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HMGA2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞增殖能力較空載體組增強(qiáng)（P＜0.05），過(guò)表達(dá)HMGA2促進(jìn)了垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞所占比例較空載體組明顯減少，而S期細(xì)胞所占比例明顯增加，可能與HMGA2調(diào)節(jié)下游相關(guān)蛋白有關(guān)，研究表明HMGA2通過(guò)增強(qiáng)E2F轉(zhuǎn)錄因子1活性誘導(dǎo)垂體腫瘤發(fā)生［13］。HMGA2與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRB）相互作用，取代了磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白／E2F轉(zhuǎn)錄因子1（pRB／E2F1）復(fù)合物中的組蛋白脫乙?；?（HDAC1），增加了E2F1乙?；娃D(zhuǎn)錄活性。除此之外HMGA2還可以直接作用于E2F1敏感元件，增強(qiáng)E2F1與DNA結(jié)合能力。與上述結(jié)果一致，HMGA2轉(zhuǎn)基因和E2F1基因敲除雜交鼠中E2F1活性功能性的丟失明顯的減少了垂體腺瘤的發(fā)生率［13］。垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子-1（pit-1）是一個(gè)與垂體細(xì)胞發(fā)育和分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其高表達(dá)是人類生長(zhǎng)激素（GH）和催乳素（PRL）腺瘤的一個(gè)恒定特點(diǎn)，有研究表明HMGA2蛋白可以結(jié)合pit-1及其敏感DNA元件，以此正向調(diào)節(jié)pit-1啟動(dòng)子，同時(shí)HMGA2還可以與pit-1協(xié)同作用，促進(jìn)pit-1表達(dá)上調(diào)［14］。研究證明，在HMGA轉(zhuǎn)基因鼠垂體腺瘤中，HMGA蛋白正向調(diào)控pit-1轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)垂體腫瘤中pit-1過(guò)度表達(dá)［15］。此外，HMGA2還可以上調(diào)CCNB2基因誘導(dǎo)垂體瘤發(fā)生。CCNB2可以編碼周期蛋白B2，它是B型周期蛋白家族的一員，是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)裝置的主要成分，HMGA2蛋白主要通過(guò)結(jié)合細(xì)胞周期蛋白B2基因啟動(dòng)子，上調(diào)其活性，誘導(dǎo)垂體瘤發(fā)生［16］。本實(shí)驗(yàn)中HMGA2過(guò)表達(dá)促進(jìn)垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞增殖并且促進(jìn)G1期進(jìn)展，表明過(guò)表達(dá)HMGA2在垂體腫瘤發(fā)生中具有重要作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)基于成功培養(yǎng)原代垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞后進(jìn)行，其性質(zhì)和特點(diǎn)上更接近于腫瘤在人體原始狀態(tài)，這為垂體腺瘤的生物治療提供了新的治療靶點(diǎn)，同時(shí)也為垂體腺瘤機(jī)制的進(jìn)一步探索提供了基礎(chǔ)。

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