代紅瑩，王世偉，朱天金，王 科

（重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院：1.檢驗科，2.感染科 402160）

乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝），是由乙型肝炎病毒（HBV）感染機體后所引起的疾病。2010年版慢性乙型肝炎防治指南指出慢性乙型肝炎治療的總體目標是：最大限度地長期抑制HBV，減輕肝細胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和減少肝臟失代償、肝硬化、肝癌及其并發(fā)癥的發(fā)生［1］。循證醫(yī)學研究表明長期使用核苷（酸）類似藥物可能導致HBV基因產(chǎn)生耐藥性突變，從而導致病情反復或反彈［2-3］。本研究通過分析永川地區(qū)乙型肝炎患者治療過程中的乙型肝炎耐藥情況，對了解該地區(qū)乙型肝炎病毒分型，減少HBV變異和耐藥的產(chǎn)生，指導臨床合理治療乙型肝炎具有重要意義［4］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2012年12月間來本院門診和住院的慢性HBV感染者共605例，其中男379例，女226例，年齡15～65歲，診斷按照慢性乙型肝炎診斷（2010版）［1］的診斷標準，所有病例其他類型的肝炎病毒（甲、丙、丁、戊、庚）均為陰性，所有樣本收集均征得患者同意，并與患者簽訂了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 靜脈采集慢性乙型肝炎患者不抗凝血3 mL，2 000r／min，離心5min，分離血清置1.5mL EP管中，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量PCR檢測 循環(huán)參數(shù)設定：尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）反應50℃，2min；Taq酶活化94℃，2min；變性94℃，10s；退火；延伸及熒光采集60℃，30s；PCR儀冷卻35℃，10s；詳細操作按熒光定量試劑盒說明書。HBV DNA定試劑盒量（上?？迫A生物工程股份有限公司），熒光定量PCR儀（上海宏石有限公司）。

1.2.3 基因芯片反向斑點雜交檢測 HBV DNA耐藥基因芯片試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司），F(xiàn)YY-3型分子雜交儀（興化市分析儀器廠），PCR擴增儀（中國杭州博日有限公司），HBV DNA提取及擴增、雜交條件的具體操作按說明書。根據(jù)顯色（藍色斑點）出現(xiàn)的陣列位點直接判讀HBV的基因型和耐藥突變類型。

1.2.4 血清標志物檢測 乙型肝炎病毒血清標志物和甲、丙、戊、庚型肝炎病毒抗體檢測試劑盒由廈門新創(chuàng)公司提供，具體操作按照說明書。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，采用t檢驗進行單因素統(tǒng)計學分析，率的比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢性乙型肝炎患者HBV基因分型情況 605例慢性乙型肝炎患者中，B型基因型382例（63.1%），C型基因型189例（31.2%），B、C混合基因型18例（3.0%），D 基因型9例（1.5%），B、C、D以外的其他基因型7例（1.2%）。B型慢性乙型肝炎患者所占百分比明顯高于C型，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 慢性乙型肝炎患者HBV B、C、D基因型耐藥情況 605例慢性乙型肝炎患者中，516例對拉米夫定敏感，35例對拉米夫定耐藥，57例對阿德福韋酯耐藥，23例表現(xiàn)為多重耐藥性。57例對阿德福韋酯耐藥的突變基因型中，耐藥基因型表現(xiàn)為B型基因型和C型基因型為主，B、C混合型與其他型未見耐藥，其突變基因型以236T為主，且多見于B基因型，B型236T基因突變型為35.09%，B型基因型和C型基因型的236T基因突變型為50.80%，見表1。35例對拉米夫定耐藥，耐藥以B、C型基因型為主，其他型未見耐藥。其突變基因型以rt108M為主，且多見于B基因型。B型rt108M基因突變型為34.29%。B型基因型和C型基因型的rt108M基因突變型為48.57%，見表2。

表1 HBV B、C基因型與阿德福韋酯耐藥變異類型的關系［n（%）］

表2 HBV B、C基因型與拉米夫定耐藥變異類型的關系［n（%）］

2.3 HBV耐藥患者乙型肝炎DNA復制數(shù)與未發(fā)生HBV耐藥DNA復制數(shù)關系 臨床上應用核苷（酸）類藥物治療出現(xiàn)耐藥的116例患者，常見耐藥位點為：rta181V、rt236T、rt204V、rt180M，患者發(fā)生乙型肝炎耐藥后HBV病毒（7.08±4.12）×106copy／mL，而未發(fā)生乙型肝炎耐藥后 HBV病毒（6.08±3.52）copy／mL，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

目前，HBV可分為A～I基因型。HBV基因型分布有明顯地域性，文獻報道國內(nèi)HBV基因型以B型、C型和D型為主。HBV基因型分布在中國存在明顯地區(qū)和民族差異。北方以C型為主，南方以B型為主，漢族以B、C為主，D型少見。經(jīng)對永川地區(qū)乙型肝炎患者的HBV基因型分析發(fā)現(xiàn)，在605例慢性乙型肝炎患者中，B基因型382例（63.1%）；C基因型189例（31.2%）；B，C混合基因型18例（3.0%）；D基因型9例（1.5%）；B，C，D以外的其他基因型7例（1.2%）。結(jié)果表明：HBV基因型以B型為主，C型較少，與目前文獻報道比較一致［5-6］。本研究在對乙型肝炎耐藥性研究的同時采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測其他肝炎病毒血清學指標，有效保證患者為單純乙型肝炎病毒感染引起慢性乙型肝炎，只有其他類型的肝炎病毒（甲、乙、丙、丁、戊、庚）均為陰性的患者才能作為研究納入研究對象，這樣可防止臨床并發(fā)其他病毒感染患者對實驗的干擾。

拉米夫定是最早被用于乙型肝炎抗病毒治療藥物［7］，其主要是通過抑制乙型肝炎DNA的合成發(fā)揮作用，拉米夫定的耐藥突變位點主要集中在逆轉(zhuǎn)錄酶C區(qū)上的YMDD基因序列與保守B區(qū)（主要包括rt108M、rt204V、rt204I3個突變位點），由于拉米夫定使用早，易發(fā)生突變，臨床已不常使用［8-10］。本研究發(fā)現(xiàn)永川地區(qū)乙型肝炎耐藥主要表現(xiàn)為對阿德福韋酯耐藥，這可能與臨床醫(yī)生廣泛使用阿德福韋酯治療乙型肝炎有關。阿德福韋酯作為一種腺苷酸的類似物，具有廣譜抗病毒特點，其主要通過競爭性的抑制dATP結(jié)合到病毒DNA上，從而阻止病毒DNA的合成。阿德福韋酯耐藥突變主要表現(xiàn)為HBV逆轉(zhuǎn)錄酶B區(qū)的rtA181V和D區(qū)的rt236T［11］。57例對阿德福韋酯耐藥的突變基因型中，表現(xiàn)為B和C基因型出現(xiàn)耐藥（38例為B型，19例為C型），B，C混合型與其他型未見耐藥。突變基因型以236T為主，未檢測出207I突變基因型。研究還表明：永川地區(qū)B型較C型更容易對阿德福韋酯產(chǎn)生耐藥，臨床乙型肝炎患者一旦發(fā)生HBV耐藥后病毒復制相數(shù)對較高，而未發(fā)生耐藥患者，病毒復制數(shù)普遍偏低，提示：慢性乙型肝炎患者治療過程要重視HBV耐藥性發(fā)生，加強對乙型肝炎治療效果的評估，建議臨床醫(yī)生在乙型肝炎治療過程中密切關注病毒復制和耐藥情況。一但發(fā)生耐藥要及時調(diào)整治療方案，如對于拉米夫定、恩替卡韋發(fā)生耐藥者，可加用阿德福韋酯聯(lián)合治療。對于阿德福韋酯耐藥者，可加拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋聯(lián)合治療，以提高治療效果［12-13］。

HBV耐藥基因檢測方法主要有質(zhì)譜分析法、限制性片段長度多態(tài)法、線性探針分析法、熒光定量PCR熔解曲線分析法、基因芯片技術等［14］。本研究采用PCR擴增法和DNA反向斑點雜交相結(jié)合的基因芯片技術，可一次性檢測HBV 3種常見基因型（B、C、D型）及對臨床上所用藥物拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋等常見耐藥相關點的突變檢測。該法準確度高、靈敏高和特異性好、檢測速度快，值得在臨床廣泛推廣使用［15］。

［1］中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27（1）：1-16.

［2］方芳，馮鋼，浦春，等.慢性乙型肝炎患者乙肝病毒B、C基因型和阿德福韋酯耐藥基因的相關性［J］.皖南醫(yī)學院學報，2012，31（4）：291-294.

［3］Li XD，Wang L，Liu Y，et al.Characterization of hepatitis B virus genotypes／subgenotypes in 1 301patients with chronic hepatitis B in North China［J］.Chin Med J（Engl），2011，124（24）：4178-4183.

［4］張智，張珍，李楠，等.185例廣東人乙型肝炎病毒基因分型及耐藥基因檢測［J］.廣東醫(yī)學，2008，29（1）：97-98.

［5］Mirandola S，Campagnolo D，Bortoletto G，et al.Largescale survey of naturally occurring HBV polymerase mutations associated with anti-HBV drug resistance in untreated patients with chronic hepatitis B［J］.J Viral Hepat，2011，18（7）：e212-216.

［6］蔣孝華，李小芬，蔡亞平，等.HBV基因型與耐藥變異的關系［J］.中國感染控制雜志，2009，8（3）：160-163.

［7］韓剛，陳琳，吳月平.熒光PCR法檢測HBV感染者HBV基因型及其臨床應用［J］.南通大學學報：醫(yī)學版，2012，32（1）：61-62.

［8］Peng CY，Chien RN，Liaw YF.Hepatitis B virus-related decompensated liver cirrhosis：benefits of antiviral therapy［J］.J Hepatol，2012，57（2）：442-450.

［9］Vivekanandan P，Singh OV.Molecular methods in the diagnosis and management of chronic hepatitis B［J］.Expert Rev Mol Diagn，2010，10（7）：921-935.

［10］蘇義，王文慶.乙肝病毒拉米夫定耐藥基因變異情況分析［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2010，13（7）：986.

［11］戴晨陽，劉麗，梁樹人，等.658例乙型肝炎患者HBV多位點耐藥基因檢測結(jié)果分析［J］.山東醫(yī)藥，2012，52（7）：56-58.

［12］Sayan M，Akhan SC，Senturk O.Frequency and mutation patterns of resistance in patients with chronic hepatitis B infection treated with nucleos（t）ide analogs in add-on and switch strategies［J］.Hepat Mon，2011，11（10）：835-842.

［13］Song BC.How to overcome antiviral-resistant hepatitis B virus？［J］.Intervirology，2010，53（1）：29-38.

［14］Lapiński TW，Pogorzelska J，F(xiàn)lisiak R.HBV mutations and their clinical significance［J］.Adv Med Sci，2012，57（1）：18-22.

［15］Damerow H，Yuen L，Wiegand JW，et al.Mutation pattern of lamivudine resistance in relation to hepatitis B genotypes：hepatitis B genotypes differ in their lamivudine resistance associated mutation pattern［J］.J Med Virol，2010，82（11）：1850-1858.