張宇晴，徐優(yōu)慧，黎文婷，鄒學森，羅達亞，陳文學，黃秀珍

（1.江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，南昌330029；2.江西中醫(yī)藥大學病理教研室，南昌330004；3.江西省兒童醫(yī)院，南昌330006；4.南昌大學醫(yī)學院生化與分子生物學教研室，南昌330006）

胃泌素是一種胃腸激素，大量研究表明胃泌素對胃腸道腫瘤細胞生物學行為有影響，但其在促進胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移方面的機制目前還不清楚。胃癌高表達的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases，MMP-2）可促進腫瘤細胞的組織浸潤和擴散，E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）低表達可使胃癌細胞易于由基質(zhì)解離而轉(zhuǎn)移［1］。DNA甲基化是哺乳動物細胞重要的基因表達調(diào)控方式，主要發(fā)生在基因啟動子區(qū)富含CpG島的區(qū)域，一旦這些CpG島被甲基化，則相應(yīng)的基因便會處于失活狀態(tài)，換言之，甲基化可以使這個基因低表達?；虮磉_模式變化將影響到細胞生物學行為，導致腫瘤細胞的分化與轉(zhuǎn)移。本文旨在在胃泌素及其受體拮抗劑干預下觀察胃癌細胞MMP-2和E-Cadherin基因甲基化變化情況，從而探討胃泌素在胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 MKN45胃癌細胞系由南昌大學一附院消化疾病研究所提供，5肽胃泌素購自上海麗珠東風生物技術(shù)公司，丙谷酰胺（分析純）購自江蘇金壇制藥廠，甲基化和非甲基化引物由生工生物工程公司合成，DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，熒光定量試劑盒（Takara Dalian）SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，DA7600自動實時熒光PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 MKN45胃癌細胞系培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，加10%小牛血清，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液，3d傳代1次。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將胃泌素濃度調(diào)為50μg／mL，丙谷胺濃度為64 μg／mL。實驗共分4組：空白對照組、胃泌素組、丙谷胺組和胃泌素加丙谷胺組。

1.2.2 DNA提取 取傳代后72h的細胞，用含10%小牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×105接種于6孔培養(yǎng)皿，每孔1.2mL，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，空白組加含10%小牛血清培養(yǎng)液10.0mL，胃泌素組加胃泌素液5.0mL，丙谷胺組加丙谷胺液5.0mL，再各加含10%小牛血清培養(yǎng)液5.0mL，胃泌素加丙谷胺組二者各加5.0mL。培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)皿，從培養(yǎng)皿移去培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化方法收集細胞，按照EasyPureTM Genomic DNA試劑盒說明書進行DNA提取。提取的組DNA經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測其完整性，經(jīng)紫外分光光度計檢測A260／A280均在1.8～2.0之間。

1.2.3 DNA硫化并純化處理 基因組DNA首先經(jīng)過亞硫酸氫鈉化學修飾，若啟動子區(qū)CpG島未甲基化，則胞嘧啶（C）變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而已甲基化的胞嘧啶（Cm）則不變，再根據(jù)堿基的變化分別設(shè)計甲基化特異性引物（M）和未甲基化特異性引物（U）。DNA修飾后用吸附柱純化去除游離亞硫酸氫鈉后以此作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.4 甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）的引物序列 E-Cadherin甲基化上游引物5′-TAA TTA GCG GTA CGG GGG GC-3′［2］，下游引物5′-CGA AAA CAA ACG CCG AAT ACG-3′，產(chǎn)物大小170bp；非甲基化上游引物5′-TTA GTT AAT TAG TGG TAT GGG GGG TGG-3′下游引物5′-ACC AAA CAA AAA CAA ACA CCA AAT ACA-3′，產(chǎn)物大小182bp；MMP-2甲基化上游5′-GGT GGT TAT ATG TAT TGA GTT AGT GA-3′，下游引物5′-ACT CTT TAT CCA TTT TAA AAA CAAC-3′［3］，產(chǎn)物大小210bp；非甲基化上游引物5′-GCG GTT ATA CGT ATC GAG TTA GC-3′下游引物：5′-ACT CTT TAT CCG TTT TAA AA A CGAC-3′，產(chǎn)物大小205bp。PCR的反應(yīng)體積為20μL，2×SYBR Premix Ex Taq，DNA 模 板 2μL，上、下游引物（10 pmol／μL）各0.8μL，加水至20μL。循環(huán)擴增條件：E-Cadherin 95℃60s；95℃5s，64℃30s，40個循環(huán)；MMP-2：95℃60s；95℃5s，59℃30s，40個循環(huán)。溶解曲線可判斷其特異性，系列稀釋的DNA模板標準量觀察擴增效率。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用±s表示。兩樣本均數(shù)比較，方差齊時采用兩獨立樣本t檢驗，方差不齊時行秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSP產(chǎn)物的確定和分析 熔解曲線分析顯示，兩基因相應(yīng)兩對引物都擴增出了特異性的產(chǎn)物，其峰值所對應(yīng)的溫度與預期產(chǎn)物的Tm值一致，未出現(xiàn)其他異常波形，波的形狀也較銳利，見圖1。表明實驗中所應(yīng)用的實時檢測系統(tǒng)能分別擴增出各自特異性的產(chǎn)物。

圖1 MMP-2和E-Cadherin甲基化和非甲基化熔解分析曲線圖

2.2 各組MSP檢測產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 如圖2所示，甲基化產(chǎn)物與非甲基化產(chǎn)物均為單一條帶且與預期片段大小一致。在空白組中，甲基化和非甲基化擴增產(chǎn)物中均電泳出單一條帶，說明干預前兩基因部分處于甲基化，部分處于非甲基化狀態(tài)。在受到干預后，甲基化和非甲基化中均擴增出單一產(chǎn)物，說明在胃泌素干預前、后MMP-2和E-Cadherin基因均處于半甲基化狀態(tài)。

圖2 MMP-2和E-Cadherin各組MSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 各干預組與空白組甲基化相對量比較 運用上述建立的MSP方法，分析胃泌素和丙谷酰胺對胃癌細胞中E-Cadherin和MMP-2基因甲基化的影響作用（n＝5），采用比較Ct值法計算公式2-△t（△Ct＝ 甲基化Ct值-非甲基化Ct值）法來進行半定量，顯示各組甲基化相對非甲基化水平改變。胃泌素組與空白組比較，MMP-2基因甲基化水平顯著下降（P＜0.05），而E-Cadherin基因甲基化水平明顯升高（P＜0.05），丙谷胺組和胃泌素加丙谷胺組相對空白組，MMP-2基因甲基化水平無明顯變化（P＞0.05），然而E-Cadherin基因甲基化水平則顯著下降（P＜0.05）。

圖3 MMP-2和E-Cadherin各組甲基化相對非甲基化水平改變比較分析

3 討 論

近年來，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，DNA甲基化與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。特定基因啟動子區(qū)域甲基化變化可以作為癌癥的臨床診斷的輔助性標志來預測癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預后［4］。基因甲基化不但是腫瘤發(fā)生的原因之一，而且在腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮作用。胃癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移是必然的生物學過程，是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移是決定治療原則最重要的因素，也是患者死亡的主要原因。而此過程與細胞黏附分子、降解酶類、癌細胞的運動等密切相關(guān)。多種研究證實胃癌組織存在E-Cadherin低表達和MMP-2［5-6］高表達，胃泌素可能對這兩個基因的表達有一定控制作用。本實驗用胃泌素干預MKN45胃癌細胞株，觀察E-Cadherin和MMP-2基因啟動子區(qū)CpG島甲基化的生物學效應(yīng)。

MMPs是一類高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，其可降解基底膜和細胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員之一，主要降解明膠及Ⅳ型膠原。多個研究顯示胃癌中MMP-2異常高表達，并且有研究證實 MMP-2與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［7］。實驗數(shù)據(jù)表明胃泌素可以顯著降低 MMP-2基因甲基化水平（P＜0.05），丙谷酰胺組及胃泌素加丙谷酰胺組相對空白組能一定程度提高MMP-2基因甲基化水平，并且可以一定程度抑制胃泌素對細胞株的受體效應(yīng)，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明胃泌素在提高MMP-2基因表達方面發(fā)揮重要作用，而丙谷胺則可一定程度上抑制MMP-2的表達。胃泌素降低了MMP-2基因甲基化水平，則相應(yīng)的基因便會處于活躍狀態(tài)，基因啟動子區(qū)呈開放狀態(tài)，從而可促進MMP-2基因表達相應(yīng)的蛋白。國內(nèi)外研究表明MMP-2表達量與胃癌惡性程度相關(guān)［5-6］，MMP-2降解細胞外基質(zhì)，并重塑腫瘤組織循環(huán)，從而導致胃癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移，這說明胃泌素通過MMP-2甲基化變化對胃癌細胞生物學行為方面有著重要影響［8］。丙谷酰胺和胃泌素加丙谷酰胺組能在一定程度上提高MMP-2基因甲基化水平，但不明顯。以上結(jié)果說明胃泌素可通過MMP-2促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移，而丙谷胺可一定程度抑制其生物學行為。

E-Cadherin作為最重要的黏附分子，是一種腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移抑制劑，其生理功能主要是介導上皮細胞黏附、維持組織結(jié)構(gòu)完整性，并維持細胞極性和參與分化。E-Cadherin失活與多種腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其失活機制主要有：基因突變、雜合性缺失、甲基化等。本實驗探討其甲基化變化，結(jié)果表明胃泌素可明顯提高MKN45胃癌細胞E-Cadherin基因甲基化水平（P＜0.05），其拮抗劑丙谷酰胺明顯抑制E-Cadherin基因甲基化（P＜0.05），在一定程度上可促進體外胃癌細胞E-Cadherin表達，而胃泌素抑制其表達。說明胃泌素在腫瘤侵襲方面起促進作用，而丙谷胺則可能起抑制作用。Sun等［9］證實人胃癌細胞株MKN-45在使用胃泌素受體拮抗劑后胃癌細胞更易于發(fā)生凋亡，并發(fā)現(xiàn)是通過上調(diào)細胞凋亡促進基因Bax基因和下調(diào)細胞凋亡抑制基因Bcl-2基因來實現(xiàn)的。丙谷胺可一方面抑制侵襲轉(zhuǎn)移，另一方面可促進癌細胞凋亡。腫瘤細胞黏附相關(guān)基因的啟動子區(qū)高甲基化導致基因沉默可引起腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移能力的增強。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的基因組甲基化水平與正常細胞相比有著特有DNA甲基化區(qū)域（cancer-specific differentially DNA-methylatedregion，cDMR），用基因組亞硫酸鹽測序發(fā)現(xiàn)相同的cDMR隨機的甲基化差異導致了不同類型的腫瘤，引起CpG島的甲基化水平發(fā)生異常［10］。研究認為DNA甲基化模式的維持是由一系列甲基化、去甲基化、組蛋白乙酰化及多種甲基結(jié)合蛋白狀態(tài)之間動態(tài)平衡所決定［11］。本實驗也表明 MMP-2和E-Cadherin均存在半甲基化狀態(tài)，它已成為經(jīng)典的造成基因表達紊亂的"第二次打擊模式"。王麗等［12］實驗證明，胃泌素在胃正常上皮細胞、慢性萎縮性胃炎、胃上皮不典型增生的表達呈現(xiàn)遞減的趨勢，胃泌素表達水平的變化可能為胃癌發(fā)生前的一種狀態(tài)。有實驗用小干擾RNA干擾胃泌素基因的表達而降低胃泌素的表達，干擾胃泌素基因表達后可以顯著抑制胃癌細胞的遷移［13］，Ajani等［14］用胃泌素免疫抗原特異性的抗胃泌素抗體，從而抑制了腫瘤細胞的增殖和浸潤。多種研究證實胃泌素參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，隨著腫瘤生長調(diào)節(jié)機制研究的不斷深入，人們可望通過操縱激素的方法選擇胃泌素依賴性胃癌進行內(nèi)分泌治療。

如何確定哪些基因的甲基化水平改變是導致癌癥發(fā)生的主要原因，有研究者發(fā)現(xiàn)，癌細胞要生存必需有一些基因沉默表達，而主要是因為這些基因啟動子區(qū)域是高度甲基化狀態(tài)導致［15］。DNA甲基化是基于非序列改變所致表達水平變化，是可控、可調(diào)的變化。因此在癌癥中高甲基化的基因可以作為癌癥治療的一個靶點，可以通過使用去甲基化試劑使高甲基化的基因恢復表達［16］。甲基化變化為人類在腫瘤發(fā)病機制研究及其早期診斷和治療方面開辟新的途徑。因此，針對胃泌素導致胃癌細胞相關(guān)基因表達模式變化，進行藥物聯(lián)用和尋找特異性調(diào)節(jié)甲基化酶活性的藥物是胃癌治療的一個方向。

［1］Graziano F，Humar B，Guilford P.The role of the E-Cadherin gene（CDHI）in diffuse gastric cancer susceptibility：from the laboratory to clinical practice［J］.Ann Oncol，2003，14（12）：1705-1713.

［2］Bornman DM，Mathew S，Alsruhe J，et al.Methylation of the E-Cadherin gene in bladder neoplasia and in normal urothelial epithelium from elderly individuals［J］.Am J Pathol，2001，159（3）：831-835.

［3］Farias，Lucyana Conceicao，Gomes，Carolina Cavalieri.Epigenetic regulation of matrix metalloproteinase expression in ameloblastoma［J］.BMC Clin Pathol，2012（12）：11.

［4］Deng D，Liu Z，Du Y，et al.Epigenetic alterations as cancer diagnostic，prognostic，and predictive biomarkers［J］.Adv Genet，2010（71）：125-176.

［5］Chen D，Wang Y，Zhang K，et al.Antisense oligonucleotide against clusterin regulates human hepatocellular carcinoma invasion through transcriptional regulation of matrix metalloproteinase-2and E-Cadherin［J］.Int J Mol Sci，2012，13（8）：10594-10607.

［6］Guo XT，Wang JF，Zhang LY，et al.Quantitative assessment of the effects of MMP-2polymorphisms on lung carcinoma risk［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（6）：2853-2856.

［7］Curran S，Murray GI.Matrix metalloproteinases：molecular aspects of their roles in tumour invasion and metastasis［J］.Eur J Cancer，2000，36（13）：1621-1630.

［8］Zheng H，Takahashi H，Murai Y，et al.Expressions of MMP-2，MMP-9and VEGF are closely linked to growth，invasion，metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma［J］.Anticancer Res，2006，26（5A）：3579-3583.

［9］Sun WH，Zhu F，Chen GS，et al.Blockade of cholecystokinin-2receptor and cyclooxygenase-2synergistically induces cell apoptosis，and inhibits the proliferation of human gastric cancer cells in vitro［J］.Cancer Lett，2008，263（2）：302-311.

［10］Hansen KD，Timp W，Bravo HC，et al.Increased methylation variation in epigenetic domains across cancer types［J］.Nat Genet，2011，43（8）：768-775.

［11］Rhee I，Bachman KE，park BH，et al.DNMT1and DNMT3bcoopcrate to silence genes in human cancer cells［J］.Nature，2002，416（6880）：552-556.

［12］王麗，周麗雅，李淵，等.胃泌素在胃炎與胃癌中表達的差異及意義［J］.中國微創(chuàng)外科雜志，2011，5（11）：435-436.

［13］茆家定，錢海鑫，吳佩，等.ERK-MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在胃泌素促進人結(jié)直腸癌細胞增殖中的作用及其機制［J］.中華消化外科雜志，2013，12（2）：139-144.

［14］Ajani JA，Hecht JR，Ho L，et al.An open-label，multinational，multicenter study of G17DT vaccination combined with cisplatin and 5-fluorouracil in patients with untreated，advanced gastric or gastroesophageal cancer：the GC4 study［J］.Cancer，2006，106（9）：1908-1916.

［15］De Carvalho DD，Sharma S，You JS，et al.DNA methylation screening identifies driver epigenetic events of cancer cell survival［J］.Cancer Cell，2012，21（5）：655-667.

［16］Yoo CB，Jones PA.Epigenetic therapy of cancer：past，present and future［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（1）：37-50.