郭軍霞，高東升，甘立軍，代玉川，李傳方

（1.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250012;2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)寧 272029）

左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）是高血壓最常損害的的靶器官之一，其發(fā)生率為30% ～40%，目前認(rèn)為高血壓LVH是心血管病事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。在研究高血壓LVH的病因中，發(fā)現(xiàn)腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）系統(tǒng)中ACE基因DD基因型與LVH有著密切的關(guān)系［2］，但是國(guó)內(nèi)外研究較多的是單個(gè)基因與高血壓LVH的關(guān)系，聯(lián)合基因作用與LVH相關(guān)性的報(bào)道極少。β-肌球蛋白重鏈基因（beta-myosin heavy chain gene，MYH7）位于14號(hào)染色體1區(qū)1帶和2帶之間，編碼肌球蛋白，目前MYH7基因已發(fā)現(xiàn)160多種不同突變類型，臨床上主要導(dǎo)致心室肌肥厚，甚至猝死等惡性事件［3］。遺傳學(xué)研究表明原發(fā)性高血壓為多基因病，其靶器官損害也可能是多基因共同參與的過(guò)程，本研究利用聯(lián)合作用進(jìn)一步探索高血壓LVH的候選基因，從遺傳學(xué)角度防治高血壓靶器官損害。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取203例原發(fā)性高血壓患者來(lái)自2011年6月至2012年2月濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院患者，100例非高血壓者為濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康查體者，其中男151例，女152例，平均年齡（59.9±12.1）歲。根據(jù)2010年版中國(guó)高血壓防治指南，高血壓患者入選標(biāo)準(zhǔn)診室測(cè)量血壓收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），除外繼發(fā)高血壓、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、心臟瓣膜病、心力衰竭、惡性腫瘤、免疫疾病、感染、創(chuàng)傷、肝腎功能衰竭、服用免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物、激素替代治療的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)的患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床表型測(cè)定:測(cè)所有受試者血壓、身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI）和體表面積（BSA）。清晨空腹抽取靜脈血，測(cè)定一般生化指標(biāo)（肝、腎功能，血脂、血糖）。

1.2.2 左心室肥厚測(cè)定:采用荷蘭飛利浦IE33型號(hào)彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率2.5 MHz，M型超聲心動(dòng)圖測(cè)量左心室長(zhǎng)軸腱索水平測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、室間隔厚度（IVSd）、左心室后壁厚度（LVPWd）。連測(cè)3～5個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值，根據(jù) Devereux公式計(jì)算左室重量（LVM），LVM（g）=1.04×［（LVDd+IVSd+LVPWd）3－LVDd3］－13.6;左室重量指數(shù)（LVMI）（g/m2）=LVM/BSA，體表面積（BSA）=［0.006×身高（cm）+0.0128×體質(zhì)量（kg）］－0.1529。左心室肥厚診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2010年版中國(guó)高血壓防治指南推薦標(biāo)準(zhǔn)，左心室肥厚標(biāo)準(zhǔn) LVMI＞125 g/m2（男），＞120 g/m2（女）［4］。

1.2.3 基因型檢測(cè):抽取外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，應(yīng)用全血基因組DNA提取試劑盒法（離心柱型）（天根生化科技有限公司，試劑盒批號(hào):DP110413）提取DNA。

1.2.4 ACE基因I/D多態(tài)性的檢測(cè):應(yīng)用PCR擴(kuò)增ACE基因第16內(nèi)含子目的片段，引物參照文獻(xiàn)［5］設(shè)計(jì):正向 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTC T-3'，反向 5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'（由上海生物工程有限公司合成）。PCR反應(yīng):95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后，最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物加樣于3%的瓊脂糖凝膠板上，在100 V電壓下電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果（圖1），約190和490 bp處可見各自基因型條帶，隨機(jī)抽取各型PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（由上海生物工程有限公司完成，圖2）。

圖1 ACE基因型檢測(cè)電泳圖Fig 1 Electrophoresis figure testing of ACE genetype

1.2.5 MYH7基因突變的檢測(cè):應(yīng)用PCR擴(kuò)增MYH7基因第20外顯子目的片段，引物:正向5'-CATGG GTGACTCTGGACACTT-3'，反向 5'-AGTCTCCTTTCC TCACCTTGG-3'（由上海生物工程有限公司合成）。PCR反應(yīng)95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)擴(kuò)增成功（圖3），采用雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)（由上海生物工程有限公司完成）（圖4）。

圖2 ACE基因型測(cè)序圖Fig 2 Sequencing diagram of ACE genetype

圖3 MYH7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 3 PCR amplification product of MYH7 gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，遺傳平衡檢驗(yàn)采用Hardy-Weinberg平衡定律，各分組間臨床特點(diǎn)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，各組間基因分型特點(diǎn)采用χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組間臨床資料的比較

高血壓 LVH組（EH-LVH）、高血壓非 LVH（EH-NLVH）和對(duì)照組（control）。3組的年齡（age）、體質(zhì)量（BW）、體重指數(shù)（BMI）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹血糖（FBG）和肌酐（Cr）均無(wú)顯著差異性。EH-LVH組、EH-NLVH組的收縮壓、舒張壓顯著高于control組（P＜0.01）（表1）。

圖4 MYH7基因測(cè)序圖Fig 4 Sequencing diagram of MYH7 gene

2.2 基因型頻率及等位基因頻率

EH-NLVH組和control組基因型II、DD和ID頻率以及等位基因I、D分布符合Hardy-Wenibegr遺傳平衡定律，具有群體代表性。在高血壓患者中，A、B兩組基因型及等位基因頻率比較具有顯著差異（P＜0.01）（表2）。

表1 各組間臨床指標(biāo)比較Table 1 The comparison between clinical index（±s）

表1 各組間臨床指標(biāo)比較Table 1 The comparison between clinical index（±s）

*P ＜0.01 compared with control group.

index EH-LVH（n=102）EH-NLVH（n=101）control（n=100）age（years）60.6±12.4 61.5±10.3 57.6±13.3 BW（kg） 69.8±13.6 68.3±11.1 64.3±11.7 BMI（kg/m2） 25.8±6.7 24.9±7.2 24.9±6.7 ALT（U/L） 34±39 28±35 25±24 LDL（mmol/L） 2.8±0.8 2.7±0.8 2.7±0.9 FBG（mmol/L） 5.7±2.4 5.6±1.4 5.4±1.7 Cr（mmol/L） 55.0±34.5 52.7±48.7 45.1±14.5 SBP（mmHg） 145±25* 137±20* 120±11.7 DBP（mmHg） 88±18* 83±12*76±8

表2 各組ACE/ID基因型頻率和等位基因頻率分布比較Table 2 The comparison between ACE/ID genotype frequency and allele frequency distribution comparison（±s，%）

表2 各組ACE/ID基因型頻率和等位基因頻率分布比較Table 2 The comparison between ACE/ID genotype frequency and allele frequency distribution comparison（±s，%）

*P ＜0.01 compared with EH-NLVH group.

genotype frequency allele frequency group n DD ID II I D EH-LVH 10232（31.4）*49（48.0）*21（20.6）* 91（44.6） 113（55.4）EH-NLVH 10114（13.9） 37（36.6） 50（49.5） 137（67.8） 65（32.2）control 10012（12.0） 39（39.0） 49（49.0） 137（68.5） 63（31.5）

2.3 肌小節(jié)蛋白基因突變的分析

經(jīng)基因序列對(duì)比，3組中均未發(fā)現(xiàn)MYH7基因突變。

3 討論

在左心室肥厚形成的過(guò)程中有許多因素參與其中，主要分為血流動(dòng)力學(xué)和非血流動(dòng)力學(xué)。其中，遺傳因素在非血流動(dòng)力學(xué)中具有重要作用。本研究采用聯(lián)合分析研究ACE基因I/D多態(tài)性和MYH7基因突變與高血壓LVH的相關(guān)性。若具有相關(guān)性，MYH7基因的突變可作為L(zhǎng)VH遺傳易感性基因。到目前為止，ACE基因是研究較多的候選基因，因該基因的第16內(nèi)含子存在一段287 bp的Alu序列插入與缺失而呈現(xiàn)多態(tài)性，即I/D多態(tài)性。國(guó)內(nèi)外研究中，發(fā)現(xiàn)該基因型與高血壓LVH的研究結(jié)果存在差異性［6－7］。近年來(lái)多數(shù)研究認(rèn)為，DD基因型高血壓患者易發(fā)生左心室肥厚。

高血壓LVH和肥厚性心肌病引起的LVH雖發(fā)病原因不大相同，但病理組織學(xué)［8］極為相似，且都有基因遺傳學(xué)的作用參與。在肥厚性心肌病的遺傳學(xué)研究中，突變率較高的是MYH7基因，編碼β肌凝蛋白（β-MHC）重鏈。有研究在做基因篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)MYH7基因第20外顯子突變外顯率高，發(fā)病年齡、臨床癥狀出現(xiàn)較晚［9］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ACE/DD基因型修飾肥厚型心肌病的臨床表型，及DD基因型的肥厚型心肌病患者左心室重量指數(shù)大于ID型和Ⅱ型患者［10］。國(guó)內(nèi)外研究中，本研究首次分析了MYH7基因突變與ACE基因多態(tài)性聯(lián)合分析與高血壓LVH的關(guān)系，在所有研究對(duì)象中未發(fā)現(xiàn)MYH7基因突變，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析未發(fā)現(xiàn)MYH7基因突變與ACE/DD基因型之間有協(xié)同作用。本研究陰性結(jié)果的原因可能有:1）MYH7基因與高血壓LVH確實(shí)無(wú)關(guān)或存在遺傳異質(zhì)性;2）存在地區(qū)、種族的差異性;3）需進(jìn)一步擴(kuò)大收集樣本。

MYH7基因突變與ACE/DD基因型和高血壓LVH的關(guān)系尚需進(jìn)一步探討。通過(guò)人群中LVH發(fā)生的危險(xiǎn)性進(jìn)行遺傳學(xué)分析研究，可以盡早判斷發(fā)生LVH的危險(xiǎn)，對(duì)其進(jìn)行早期干預(yù)和治療，從而阻止發(fā)病和靶器官的損害，進(jìn)一步為高血壓的干預(yù)治療提供可靠的依據(jù)。

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