劉 錦 朱文杰周永紅 付志紅 李雪梅 唐雪蓮

南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院生殖科(518000)

基礎卵泡刺激素(FSH)是臨床用于評估卵巢儲備功能的重要指標之一，基礎FSH升高提示卵巢的儲備功能下降，是40歲以后女性的生理表現(xiàn)。但臨床上常見有部分婦女在40歲之前就出現(xiàn)了FSH升高現(xiàn)象，表現(xiàn)為卵泡發(fā)育的速度異常，月經周期縮短，周期第10天甚至更早就發(fā)生了排卵，導致臨床妊娠率下降，流產率增加［1］。目前治療高FSH的常用方法是用口服避孕藥反饋抑制垂體釋放FSH，達到治療的目的。研究表明口服避孕藥預處理可以增加高FSH患者體外受精-胚胎移植的成功率［2］，也有學者認為在使用口服避孕藥過程中進行垂體降調節(jié)(稱為“雙壓”方法)能抑制高FSH狀態(tài)，但其效果存在爭議。本研究通過觀察口服避孕藥治療前后子宮內膜胞飲突、白血病抑制因子(LIF)、血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、整合素β3等變化，探討口服避孕藥對高FSH患者子宮內膜容受性的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2011年12月～2012年8月，在本院就診的不孕患者中，選擇連續(xù)兩個月經周期第3天血清FSH水平＞10U/L的女性患者15例。病例納入標準:年齡＜40歲;月經周期正常，研究前3個月內無激素使用史及宮腔操作史，未放置宮內節(jié)育器。病例排除標準:多囊卵巢綜合征、排卵異常、宮腔粘連或瘢痕、宮腔積液、內膜息肉、子宮內膜異位癥或子宮肌腺癥，及既往有血栓病史者。病例年齡 33.07±4.62歲，不孕年限4.55±3.34年，基礎FSH水平18.53±5.96U/L，黃體生成素(LH)5.10±2.24U/L，雌二醇(E2)121.9±57.9pmol/L。體重指數(BMI)20.28±1.84kg/m2，月經周期 26.82±1.15d。本組研究經本院倫理委員會審查批準，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 排卵監(jiān)測和分組 月經周期第8天開始，經陰道超聲監(jiān)測卵泡生長，當優(yōu)勢卵泡直徑達14mm時，每天測卵泡大小及尿試紙法監(jiān)測LH峰預測排卵。排卵后7d取子宮內膜標本(治療前)，下次周期月經第5天開始口服避孕藥(媽富隆)1mg/d，連服21d，共3個周期。停藥后第1個月經周期排卵后7天再次取子宮內膜標本(治療后)。

1.2.2 標本采集及處理 ①采集方法:常規(guī)外陰陰道消毒，探宮腔，4～5號擴宮條擴張宮頸。將直徑0.3cm的內膜取樣器(GYNETICS公司，比利時)輕輕送入宮腔至6.5cm，外抽內芯約10cm長，負壓吸取少量內膜組織。②標本處理:將吸取的內膜組織放入4℃生理鹽水中快速洗去血污，并用干紗塊吸去水分，一部分放入4%甲醛固定液中，用于病理檢查及免疫組化測定子宮內膜容受性生化標記因子;另一部分放入2.5%戊二醛固定液中，用于掃描電鏡觀察子宮內膜胞飲突發(fā)育情況。

1.2.3 病理檢查 子宮內膜標本按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片并經 HE染色后，按病理學子宮內膜分期標準進行病理分期。

1.2.4 生化標記因子測定 免疫組化按照試劑盒步驟操作，一抗LIF、VEGF 及MMP9(BA1239、BA0407和BA0573，武漢博士德生物工程公司)按1∶50稀釋，4℃冰箱過夜;滴加聚合 HRP-羊抗兔 IgG(SV0002，武漢博士德生物工程公司)，37℃ 30min。標志物整合素β3熱修復抗原后再用3%H2O2去離子水孵育10min，一抗整合素 β3(sc-6626，santa cruz biotechnology，美國)按1∶100稀釋，4℃冰箱過夜，滴加試劑1(PV-9003，北京中杉金橋生物技術有限公司)，室溫20min，滴加試劑2(PV-9003，北京中杉金橋生物技術有限公司)，室溫20min。DAB(Tnvitrogen公司，美國)顯色結果判定標準:陰性對照片用PBS代替一抗判讀。顯微鏡(400×)下觀察，選擇5個視野，每個視野計數100個腺體細胞，分別讀出其中陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)和強陽性(+++)的細胞數。用組織學積分H-score方法進行半定量分析，計算公式:H-score=ΣPi(i+1)，其中Pi代表每一免疫組化染色范圍內同一染色強度的陽性細胞數占待測細胞總數的百分比，即Pi=陽性細胞數/待測細胞總數。i為染色強度，用1、2、3分別代表(+)、(++)、(+++)，i=0時，染色陰性，組織學積分為0。

1.2.5 內膜表面胞飲突的數量及形態(tài)觀察 內膜標本經梯度乙醇脫水、干燥和金屬鍍膜處理后，掃描電鏡下每張片觀察3個視野。計算內膜表面胞飲突的覆蓋面積:豐富(＞50%)，中等(20% ～50%)，少量(＜20%)。胞飲突的形態(tài)分為發(fā)育期、完全發(fā)育期、退縮期。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 治療前后內分泌激素及卵泡期的變化

口服避孕藥治療前后基礎 FSH、LH、E2、孕酮(P)、睪酮(T)水平，黃體中期E2、P水平均無統(tǒng)計學差異。治療后卵泡期天數長于治療前(P＜0.01)，見表1。

2.2 治療前后子宮內膜病理變化

治療前15例標本顯示分泌中期內膜9例，其余6例為增生期內膜(4例為增生反應內膜，2例呈增生-分泌反應內膜)黃體中期內膜變化與月經周期有9例(9/15)達到同步;治療后15個標本均為分泌中期反應子宮內膜，內膜發(fā)育與月經周期均達到同步，治療前后內膜與月經周期變化的同步性有差異(P＜0.01)。

2.3 掃描電鏡觀察

治療后胞飲突數量豐富，多為發(fā)育完全的胞飲突;治療前胞飲突數量稍欠豐富，多處在發(fā)育中期和退縮期，治療前后胞飲突形態(tài)有差異(P＜0.05)，但豐富程度無差異(P＞0.05)。見表2，圖1。

表115 例治療前后內分泌激素水平及卵泡期天數比較()

表115 例治療前后內分泌激素水平及卵泡期天數比較()

＊治療前后比較P＜0.01

項目 治療后 治療前P 17.72±7.41 18.53±5.96 0.770基礎LH(U/L) 4.70±2.50 5.10±2.24 0.627基礎E2(pmol/L) 141.7±105.90 122.25±58.10 0.603基礎P(nmol/L) 1.18±1.02 1.53±0.67 0.352基礎T(nmol/L) 1.21±1.04 1.11±2.26 0.647黃體期E2(pmol/L) 548.67±246.39 776.83±482.75 0.135黃體期P(nmol/L) 40.96±21.53 46.52±24.90 0.468卵泡期天數 15.53±4.05 13.26±1.23 0.009基礎FSH(U/L)*

表2 治療前后子宮內膜胞飲突數量和發(fā)育情況比較［個(%)］

圖1 不同發(fā)育階段的胞飲突形態(tài)

2.4 內膜腺體LIF、VEGF、MMP9和整合素β3表達情況

治療前后子宮內膜腺體LIF、整合素β3表達量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而內膜腺體VEGF、MMP9表達量無統(tǒng)計學差異(圖2，表3)。

圖2 子宮內膜LIF、整合素β3、MMP9和VFGF的表達

表3 治療前后內膜腺體激素表達量比較(s)

表3 治療前后內膜腺體激素表達量比較(s)

*治療前后比較P＜0.05

項目 治療后 治療前P LIF 2.41±0.50 1.91±0.46 0.031*整合素β3 2.39±0.41 2.10±0.26 0.033*MMP9 3.04±0.96 2.88±0.97 0.756 VEGF 2.47±0.52 2.20±0.37 0.142

3 討論

本組研究發(fā)現(xiàn)高FSH不孕患者常發(fā)生卵泡期縮短，甚至在月經周期第10天即發(fā)生排卵。黃體中期子宮內膜轉化與月經周期不同步，有40%的黃體中期子宮內膜仍處于增生期，這將導致內膜容受性低下，胚胎種植困難。筆者認為，這可能是高FSH患者臨床妊娠率低下，流產率升高的原因之一。

正常狀態(tài)的子宮內膜僅在一個極短的關鍵時期內，即排卵后6～7d天(又稱種植窗期)具有容受胚胎的能力。整合素、LIF、VEGF以及MMP9是眾多研究公認的種植窗期子宮內膜容受性標記因子［3～10］，而胞飲突則是形態(tài)學上的子宮內膜容受性標記物［11，12］，本組研究選用上述意義明確的內膜容受性標記物，增加了研究結果的可信度。

口服避孕藥是一種包含有雌孕激素的類固醇激素，能夠通過負反饋抑制垂體FSH、LH的分泌，是臨床治療高FSH患者的常用藥物。但是口服避孕藥能否改善卵巢儲備功能低下的不孕患者的內膜容受性尚未見文獻報道。本組研究通過掃描電鏡觀察內膜胞飲突的發(fā)育狀態(tài)，用免疫組化方法測定內膜容受性標記因子LIF、VEGF、MMP9、整合素β3的表達情況，結果表明口服避孕藥治療后子宮內膜生長轉化與月經周期的同步性明顯改善，短卵泡期狀態(tài)得到了糾正，黃體中期(種植窗口期)完全發(fā)育胞飲突率增加，LIF、整合素β3的表達量增加，提示口服避孕藥提高了高FSH患者的子宮內膜容受性。

早在1989年 Check等［13］就曾報道過1例35歲卵巢早衰，血FSH升高的女性不孕患者經過避孕藥物治療后成功受孕。甄秀梅等［14］在短方案體外受精-胚胎移植周期前用避孕藥預處理，發(fā)現(xiàn)使用避孕藥后基礎FSH明顯下降。本組資料表明，避孕藥治療后，基礎FSH并無明顯下降，這可能是由于本組研究使用避孕藥的時間較長，卵巢儲備功能低下隨時間延長而加劇，基礎FSH水平上升，掩蓋了避孕藥中雌孕激素成分反饋抑制FSH的作用。另外，血FSH水平還受早卵泡期小卵泡分泌的抑制素影響［15］，口服避孕藥不能改變卵巢的儲備功能，因此不能改變小卵泡數和血FSH的上升。然而口服避孕藥改善了內膜發(fā)育與月經周期的同步性，使得內膜容受性因子LIF、整合素β3表達增加，完全發(fā)育胞飲突比率增加，可能與其作用于下丘腦-垂體-卵巢軸，在一定程度上調整了月經周期，減少了卵泡過早發(fā)育有關。治療后黃體中期血清E2和P水平下降，雖然沒有統(tǒng)計學意義，但從另一側面反映了口服避孕藥治療后卵泡發(fā)育或卵子質量變化的復雜性。另外，本組數據僅反應了3個月口服避孕藥治療后的第1個自然周期的狀態(tài)，這種療效能持續(xù)多久，尚有待進一步的觀察和研究。

綜上所述，高FSH不孕患者經口服避孕藥治療3個周期可調整月經周期，改善內膜發(fā)育與月經周期的同步性，提高子宮內膜容受性，有利于胚胎著床。

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