潘超，朱力，王恒樑

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

由病原微生物引起的傳染病是人類患病的主要因素，其中以嬰幼兒和老人感染最為嚴重，尤其在發(fā)展中國家這種狀況更加明顯，這其中包括一些重要的病原菌如肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌、流感嗜血桿菌、沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌等[1]。1923年Heide?berger等提出肺炎鏈球菌中血清型的不同主要由多糖決定，之后又證實皮下注射肺炎鏈球菌莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）能夠誘導機體產(chǎn)生保護性抗體，進而利用這種多糖開發(fā)出針對肺炎的疫苗[2]。隨著抗生素的使用，病原細菌感染的狀況在一段時間內得到極大的改善，使病原細菌的疫苗研究一度相對受到冷落。但抗生素濫用導致細菌耐藥性的出現(xiàn)，病原細菌的防治又成為令人頭疼的世界性難題。于是，包括多糖及多糖結合疫苗在內的各類細菌性疫苗的研制又重新引起了人們極大的興趣。

1 多糖疫苗

細菌中存在多種糖類物質，它們在細菌的識別、信號傳遞、黏附、感染及防御等方面發(fā)揮著重要作用，其中與致病性相關的包括CPS及脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS）中 的 O 抗 原 多 糖（O-antigen polysaccharide，O-PS）等。CPS是細胞莢膜的主要成分，可作為屏障保護菌體免受外界不利環(huán)境影響。O-PS由重復寡糖單位組成，是脂多糖主要的致病因子，可幫助致病菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別[3]。對大多數(shù)致病菌而言，CPS和O-PS具有免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生保護性抗體。這些多糖均屬于2型T細胞非依賴抗原（T cell-independent type 2，TI-2），進入機體后，通過與B細胞表面的抗原識別受體即表面免疫球蛋白分子（surface immunoglobulin mole?cules，sIg）交聯(lián)而激活B細胞，引起一系列下游變化，使B細胞分化為可分泌抗體的漿細胞，在整個免疫過程中并沒有T細胞的參與，因此不會形成免疫記憶，產(chǎn)生的抗體主要是親和力較低的IgM和IgG2[4-5]。

由于多糖的免疫原性，可將其制成多糖疫苗，主要是將特異性的多糖純化后制備而成。但由于多糖分子的大小決定了免疫強度的大小，某些病原菌的O-PS及低分子質量的CPS（如金黃色葡萄球菌CPS）作為疫苗的效果并不理想[1]。目前臨床上有3種莢膜多糖疫苗被廣泛使用，b型流感嗜血桿菌（Hae?mophilus influenzae type b，Hib）多糖在 Hib結合疫苗出現(xiàn)之前也有短期應用。

1.1 傷寒Vi多糖疫苗

傷寒Vi多糖疫苗是最簡單的多糖疫苗，主要利用沉淀法將Vi多糖沉淀，以乳糖作為穩(wěn)定劑。這種提取多糖的方法較溫和，可保持其原有結構[6]。在臨床試驗中，疫苗的有效率約70%，其效果與之前使用的全菌疫苗一樣，但它引起的副作用卻明顯降低[7]。

1.2 腦膜炎奈瑟球菌CPS疫苗

腦膜炎奈瑟球菌CPS疫苗是從可引起人類疾病的特異性血清型腦膜炎奈瑟球菌中純化的對熱穩(wěn)定的多糖，通過將不同血清型的多糖組合，形成了二價（A、C群）、三價（A、C、Y群）、四價（A、C、Y、W-135群）等多種多糖疫苗。上世紀60年代首次應用于美國軍隊[8]，目前已廣泛應用于旅游者等易感人群，但主要針對的是2歲以上兒童及成人。

1.3 肺炎鏈球菌CPS疫苗

目前使用的肺炎鏈球菌CPS疫苗是包含23種血清型（1、2、3、4、5、6b、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17、18C、19F、19A、20、22、23F 和 33F）的特異性多糖[9]，可有效預防老年人肺炎，具有良好的安全性，免疫后保護作用可維持5年左右，但也有統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明對高危老年人的免疫效果不理想[10]。Musher等[11]認為，由于存在遺傳因素的影響，導致該疫苗接種者對其中一些血清型并不產(chǎn)生免疫反應。

1.4 Hib CPS疫苗

Hib CPS疫苗主要成分為菌體莢膜中的多糖或多磷酸聚核糖基核糖醇（polyri-bosylribitol phos?phate，PRP）。1985年4月Hib多糖疫苗在美國上市，主要適用于2～5歲的兒童[12]。雖然這種采用PRP的多糖疫苗對于成人和年齡較大的兒童有很好的保護作用，但對小于18月齡的嬰幼兒實際有效率為零，而流行病學調查表明6個月齡嬰兒就需要相應的保護，這是該疫苗使用上的最大障礙。

總之，多糖屬于TI-2抗原，由于嬰幼兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，因此這種疫苗對2歲以下嬰幼兒基本無效，但這些人群卻最易受到病原細菌的感染。對于2歲以上人群，由于無記憶細胞，無法產(chǎn)生長久的保護作用，也需要多次免疫來維持抗體水平。盡管多糖疫苗在應用上有一定的限制，但由于經(jīng)濟性[13-14]和良好的安全性，一些多糖疫苗在人群中依然被廣泛使用。

2 多糖結合疫苗

早期動物試驗證明，當多糖連接上蛋白后可以加強其免疫原性[15]。考慮到多糖疫苗免疫效果不佳和抗生素濫用導致的耐藥性的出現(xiàn)，人們又提出了多糖結合疫苗，即將細菌的聚糖共價連接到適當?shù)牡鞍纵d體上形成糖蛋白，從而產(chǎn)生長久的免疫保護效果。糖蛋白屬于T細胞依賴抗原（T cell-depen?dent，TD），當抗原進入體內，其中的多糖部分被B細胞表面的sIg識別[16]，隨后糖蛋白被內吞；同時蛋白部分被蛋白酶降解，其中一些肽鏈被第Ⅱ類主要組織相容性復合體（MHC-Ⅱ）識別后呈遞到細胞表面；而后，肽-MHC-Ⅱ復合物被T細胞識別，最終T細胞通過直接與細胞表面蛋白相互作用及細胞因子的信號通路，促進B細胞分化成熟為漿細胞并產(chǎn)生記憶B細胞。整個過程中抗原并未與sIg產(chǎn)生交聯(lián)，因此較短的糖鏈依然可產(chǎn)生有效的免疫反應[17-18]。這種免疫機制與多糖疫苗引起的免疫機制完全不同，不僅能刺激機體產(chǎn)生非T細胞依賴免疫反應，還能引起T細胞依賴免疫反應，產(chǎn)生長久的免疫效果，因此多糖結合疫苗被認為是人類最成功的疫苗[19]。

目前，糖蛋白的形成主要有2種方法，一種是化學交聯(lián)法，另一種是生物合成法。

2.1 化學交聯(lián)法

化學交聯(lián)是指CPS或O-PS通過化學方法共價連接到載體蛋白。首先從病原菌中得到具有免疫原性的多糖，從工程菌中得到載體蛋白，將多糖和載體蛋白活化，再通過化學反應將二者共價連接，即得到糖蛋白結合疫苗。目前已應用于臨床的化學交聯(lián)法生產(chǎn)的多糖結合疫苗包括針對Hib、肺炎鏈球菌及腦膜炎奈瑟菌的多糖結合疫苗。

2.1.1 Hib多糖結合疫苗 1987年，Anderson等參與完成的第一個針對Hib的多糖結合疫苗被批準臨床使用。該疫苗主要利用高碘酸鹽活化莢膜多糖，通過還原胺化作用分別與白喉類毒素和白喉類毒素無毒突變體（cross-reacting material 197，CRM197）相連制成，臨床試驗表明，這種疫苗連續(xù)接種2次后IgG含量明顯升高[20]。此外，對于嬰兒，多糖結合疫苗中寡糖單位重復的數(shù)目對疫苗免疫原性有重要影響，20個寡糖重復單位的結合疫苗比8個寡糖重復單位的結合疫苗更容易產(chǎn)生多糖抗體，這種區(qū)別在成人中并不明顯[21]。Hilleman等[22]用溴化氰（CNBr）或水溶性碳化二亞胺將聚糖活化后，通過連接體六氨基己酸與載體蛋白（如腦膜炎奈瑟球菌B群Ⅱ型蛋白和破傷風類毒素（tetanus toxoid，TT））相連。動物實驗和臨床實驗均表明這種疫苗具有很好的免疫原性，8個月兒童可產(chǎn)生高滴度多糖抗體。1990年Donnelly等[23]將PRP多糖連接到腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白（outer membrane protein complex，OMPC）所生產(chǎn)的結合疫苗具有很好的免疫原性。Schlesinger等[24]將分別與CRM197、TT和腦膜炎奈瑟球菌OMPC連接的多糖結合疫苗Oligo-CRM、PRP-TT和PRP-OMPC多次免疫嬰兒，發(fā)現(xiàn)雖然3種疫苗均可產(chǎn)生有效的保護作用，但PRP-OMPC疫苗的抗體親和力明顯低于前2種疫苗。

2.1.2 腦膜炎奈瑟球菌多糖結合疫苗 自1999年針對腦膜炎奈瑟球菌C群的多糖結合疫苗在英國首次使用以來，腦膜炎發(fā)病率明顯降低[25]。之后，該疫苗在歐洲其他國家及加拿大等國相繼獲準上市。2005年，Sanofi Pasteur公司生產(chǎn)的腦膜炎奈瑟球菌結合疫苗Menactra在美國上市，它以白喉類毒素為載體蛋白，與4種不同血清型（A、C、W-135和Y群）多糖相連。Granoff等[26]研究了這種疫苗對機體保護的持續(xù)時間，發(fā)現(xiàn)Menactra免疫后3年對76%的受試者仍具有保護作用，而多糖疫苗只有49%。2010年，Novartis公司生產(chǎn)的疫苗Menveo獲準上市，這種疫苗以CRM197為載體蛋白，含有A、C、W-135和Y等4種血清型多糖。Gill等[27]對Menactra和Menveo的效果進行了比較，發(fā)現(xiàn)在11～18歲人群中一次注射2種疫苗22個月后均可產(chǎn)生免疫保護，但后者的血清殺菌活性明顯高于前者。2012年6月14日，美國FDA又批準了針對腦膜炎奈瑟球菌C、Y血清型和Hib的重組疫苗Menhibrix，這是第一個可用于6歲嬰兒的腦膜炎奈瑟球菌疫苗。雖然B血清型同樣引起嚴重疾病，但由于B型中的多糖與中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原相似[28]，不能引起有效的免疫反應，因此多價腦膜炎奈瑟球菌多糖結合疫苗中并無B型多糖。

2.1.3 肺炎球菌多糖結合疫苗 2000年，七價肺炎球菌多糖結合疫苗在美國上市，由惠氏公司研制，通過肺炎球菌CPS結合到蛋白載體CRM197制成。同時，Black等[29]通過臨床試驗證明七價肺炎鏈球菌結合疫苗對于兒童感染的預防具有很好的效果，而對于多糖疫苗不敏感的人群，使用多糖結合疫苗后可產(chǎn)生有效的免疫保護。目前七價肺炎鏈球菌結合疫苗已在全球100多個國家上市，通過結合疫苗的使用，肺炎發(fā)病率得到了很好的控制。

除上述已上市的通過化學交聯(lián)法生產(chǎn)的多糖結合疫苗外，還有其他一些結合疫苗正在研制中，如甲型副傷寒結合疫苗。Szu等[30]利用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸（CDAP）和CNBr活化的多糖連接到TT得到相應糖蛋白，其中后者可產(chǎn)生高水平的多糖IgG抗體，目前正在進行臨床試驗。

化學交聯(lián)方法生產(chǎn)的多糖結合疫苗可以產(chǎn)生記憶細胞，保持對病原體長久的免疫力，同時又可用于2歲以下嬰幼兒，有效克服了多糖疫苗的不足。但利用化學交聯(lián)方法生產(chǎn)疫苗需要對底物蛋白、多糖分別純化，活化后交聯(lián)，再進行第三次純化。由于純化工藝等的限制，多次純化后回收率明顯降低，從而造成資源浪費，再加上疫苗純度的要求，成本大大提高，價格隨之升高，很難在發(fā)展中國家及貧困國家推廣。此外，由于化學交聯(lián)的隨機性，使得最終產(chǎn)物的均一性不高。因此，結合疫苗的生產(chǎn)需要不斷改進工藝或探尋新的方法。

2.2 生物合成法

在很長一段時間內，人們一直認為蛋白糖基化只存在于真核生物中。自從1974年Mescher首次發(fā)現(xiàn)細菌中存在糖蛋白及糖基化修飾以來[31]，在原核、真核、古生菌等所有生命領域均發(fā)現(xiàn)蛋白糖基化的存在[32]，目前已報道的具有糖蛋白的細菌已超過70種[33]。蛋白糖基化包括O糖基化和N糖基化，細菌中大多為O糖基化，只在僅有的幾種菌中發(fā)現(xiàn)N糖基化，其中研究最為透徹的是空腸彎曲桿菌N糖基化?？漳c彎曲桿菌中的N糖基化主要由關鍵的糖基轉移酶PglB催化，其結構與真核生物糖基轉移酶OST的保守催化亞基Stt3p相似，可催化空腸彎曲桿菌糖鏈轉移至底物蛋白AcrA。2002年，Wacker等[34]首次將空腸彎曲桿菌N糖基化相關基因pglB及acrA通過載體轉移至大腸桿菌，使AcrA發(fā)生糖基化，證明單獨存在的PglB就可以催化底物蛋白AcrA發(fā)生糖基化；進一步研究發(fā)現(xiàn)PglB具有寬松的底物特異性[35]，可以使多種聚糖轉移至底物蛋白，但多糖還原端須為N-乙酰半乳糖或葡糖胺（HexNAc）[36]。底物蛋白糖基化位點也不同于真核中的保守三肽結構NXS/T，而是D/EYNXS/T的五肽結構[37]。

腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL可單獨催化腦膜炎奈瑟球菌Ⅳ型菌毛蛋白PilE發(fā)生O糖基化。2007年Faridmoayer等[38]將pglL轉移至大腸桿菌且在PglL催化下使腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白在大腸桿菌中發(fā)生了O糖基化。同PglB一樣，PglL可單獨完成催化功能。與PglB相比，PglL具有更加寬松的底物特異性，可以轉移更多的聚糖[39]。此外，綠膿桿菌O糖基化系統(tǒng)也已被轉移至大腸桿菌[38]，但糖基轉移酶PilO只能轉移短糖鏈[19]。除了以上3種糖基化系統(tǒng)通過基因工程技術被轉移至大腸桿菌外，銅綠假單胞菌、結核分枝桿菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌等微生物糖基化機制也正在深入研究中[40]。

微生物糖基化過程與細菌LPS合成相似[41]，均需要關鍵的糖基轉移酶將多糖轉移到相應載體。LPS合成中是將多糖在轉移酶催化下與脂質A核心相連；而微生物蛋白糖基化是將多糖轉移至底物蛋白。因此，Langdon等[42]提出，用生物法可以生產(chǎn)糖蛋白，并進而生產(chǎn)各種糖蛋白結合疫苗。具體方法包括3步：①將表達目的病原菌的聚糖相關基因簇通過克隆連接到適當載體并轉入大腸桿菌使其表達；②構建含有糖基化位點的載體蛋白的表達載體；③構建糖基轉移酶表達載體，將3種載體轉入適當?shù)拇竽c桿菌并誘導表達，使糖基轉移酶可以催化聚糖轉移到載體蛋白，從而形成糖蛋白，之后通過純化得到糖蛋白結合疫苗[19]。

目前，生物法生產(chǎn)糖蛋白結合疫苗的研究大多利用PglB的N糖基化來實現(xiàn)。PglB糖基化系統(tǒng)已在大腸桿菌中表達，但PglB只能催化轉移還原末端為HexNAc的多糖，如大腸桿菌、空腸彎曲桿菌、銅綠假單胞菌、志賀菌、弗朗西斯菌等菌株中的多糖，肺炎鏈球菌、豬鏈球菌等中的多糖還原端缺乏相應的位點而無法被轉移[19]。通常在多糖結合疫苗研發(fā)中，為了引起有效的免疫反應，載體蛋白大多使用的是棒狀桿菌和梭菌屬的無活性的毒素[43]。盡管有許多毒素可以引起強烈的免疫反應，但無糖基化位點，不能作為載體蛋白。2010年Ihssen等[44]在銅綠假單胞菌的外毒素A之后加了2個可與聚糖結合的序列，在大腸桿菌中使其發(fā)生糖基化，以便發(fā)酵生產(chǎn)多糖結合疫苗。Fisher等[45]則引入了糖基化位點標簽，通過在不同蛋白中連入工程化的糖基化位點標簽，使PglB識別并發(fā)生糖基化，從而通過工程方法改造合適的底物蛋白，擴大了蛋白的選擇范圍。

已有2種多糖結合疫苗進入臨床試驗，其中第一個由生物法合成的多糖結合疫苗是痢疾志賀菌1型結合疫苗，由瑞士聯(lián)邦生物技術公司所屬Glyco?Vaxyn AG公司生產(chǎn)，以銅綠假單胞菌的外毒素A作為載體蛋白，目前已完成Ⅰ期臨床試驗。此外，Gly?coVaxyn AG公司還在研制針對金黃色葡萄球菌的莢膜多糖結合疫苗，試驗表明生物法糖蛋白疫苗也適用于革蘭陽性菌的莢膜多糖[46]。

多糖疫苗作為一種新型疫苗，對傳染病的防治具有重大意義，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已從最初單純的多糖疫苗發(fā)展到現(xiàn)在的生物法合成多糖結合疫苗。多糖結合疫苗直接針對病原菌特異性多糖，同時誘發(fā)機體非T細胞依賴和T細胞依賴的免疫反應，產(chǎn)生長久的免疫保護作用，并有效解決了細菌耐藥性導致的病原微生物防治問題。生物法合成糖結合疫苗最為簡單、經(jīng)濟、高效，但限于微生物糖基化的研究才剛剛開始，對糖基化機制尚未全面了解，目前只有3套糖基化系統(tǒng)（PglB、PglL、PilO）在大腸桿菌中得到表達。PglB對糖鏈和底物的特異性要求，使其糖基化不能涵蓋所有病原菌多糖；腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL具有更寬松的底物特異性，且對糖鏈的要求不高，具有很好的應用前景；PilO只能轉移短鏈，許多病原菌糖鏈較長，且糖鏈過短會降低抗原性，因此利用PilO生產(chǎn)疫苗范圍有限。此外，目前利用生物法合成糖結合疫苗過程中，需要構建病原菌聚糖在工程菌（大腸桿菌）中表達，編碼合成聚糖的基因簇較大（往往大于10 kb），操作困難，故存在一定的局限性，因此可將糖基化系統(tǒng)轉入無毒的病原菌中來發(fā)酵生產(chǎn)多糖結合疫苗，這將是生物法合成多糖結合疫苗的另一種選擇。雖然生物法合成結合疫苗的工作剛剛起步，但已展現(xiàn)出廣闊的應用前景，有望在病原微生物防治中發(fā)揮重要作用。

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