劉建明，馬利林 ，周友浪，陳瑞新 ，徐駿飛 ，章建國，劉 杰

（南通大學附屬醫(yī)院1普外科；2手外科；3病理科，江蘇 226001）

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一,其病死率僅次于肺癌[1]。盡管包括內鏡在內的各種診斷及治療技術有所提高，胃癌病死率有所下降，但由于復發(fā)與轉移，胃癌總體預后仍很差，5年生存率不到40%[2]。近來研究表明[3-4]，腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)是腫瘤的起源，它決定腫瘤發(fā)生、治療抵抗、腫瘤進展和復發(fā)轉移。CSC是指腫瘤組織中一小部分亞群細胞，這些細胞具有自我更新能力并能形成異質化（heterogeneous）的腫瘤細胞[5]。針對CSC的研究，關鍵問題是CSC的分離、純化與鑒定。根據(jù)CSC的特性，有多種方法可分離實體瘤CSC，本文旨在探討利用懸浮球培養(yǎng)法在胃癌細胞株MKN45中分離出的球體細胞的干細胞特性。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株MKN45（上海中科院細胞庫）；N-2添加劑及B-27添加劑（Invitrogen公司）；青鏈霉素及培養(yǎng)液（Gibco公司）；人纖維生長因子-2及表皮生長因子（Chemicon公司）；CD44抗體及ECL化學發(fā)光試劑（Santa curz公司）；DAPI與4%甲醛（Sigma公司），Evagreen TM qPCR Master Mix（Biotium Inc公司）；Trizol Reagent試劑盒（Qiagen公司）；PCR引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人胃癌細胞株MKN45在含10%胎牛血清（FBS）的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞貼壁以后，收集貼壁細胞置于含無血清的1640培養(yǎng)液96孔超低粘附板中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加入1%N-2添加劑，2%B-27添加劑，1% 青鏈霉素，20 ng/mL人FGF-2和100 ng/mL表皮生長因子。觀察懸浮球形成情況，每孔100個細胞，2周后在Olympus倒置顯微鏡下放大40及100倍觀察懸浮球形成情況。當形成的懸浮球長到200～500個細胞時，將懸浮球吹散成1000個/mL細胞的溶液，按每孔100μL單細胞懸液植入含無血清培養(yǎng)液的96孔超低粘附板中，2周后觀察第2代懸浮球的形成情況，貼壁細胞作為對照組觀察成球情況。

1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）：以懸浮球體細胞為實驗組、貼壁細胞為對照組，分別取1×106個細胞提取總RNA，按照Trizol Reagent試劑盒說明書進行。用分光光度計來檢測RNA濃度，取1μg RNA按照Qiagen公司的逆轉錄試劑盒進行合成cDNA。PCR反應體系為50μL，包括25μL混合物，CD44上、下游引物各1μL，2μLcDNA模板，雙蒸水補足到50μL。95℃預變性 10分鐘，95℃變性 10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒擴增40個循環(huán)。熒光定量PCR檢測各基因的表達，引物序列見表1。操作步驟及加樣劑量按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行，每組重復實驗3次，結果用7500 System Software V 2.0分析。

表1 熒光定量PCR檢測各基因表達的引物序列

1.2.3 免疫印跡分析法(Western-Blot analysis)：懸浮球或貼壁細胞經含有蛋白酶抑制劑的裂解液裂解，并提取蛋白樣本。然后添加變性緩沖液后煮沸備用，用SDS-PAGE在8%～12%的凝膠中分離并轉移到PVDF膜上。5%牛奶封閉后加入一抗在4℃條件下孵育過夜（抗-CD441:500），TBST洗3次，然后加入標記辣根過氧化物酶的二抗室溫下培養(yǎng)2小時，TBST洗3次，最后蛋白條帶經ECL化學發(fā)光試劑曝光于柯達膠片上。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS統(tǒng)計軟件包，所有實驗至少重復3次，計量資料采用均值±標準差（）表示，均值間的差異比較采用 t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌細胞懸浮球體的形成 胃癌MKN45細胞在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天即開始形成細胞球體，培養(yǎng)至7天球體大體形成，培養(yǎng)至14天球體基本形成且中心密度増高。培養(yǎng)21天球體完全形成，球體結構飽滿，細胞排列致密，中心密度更高（圖1）。第1代球體細胞吹散后在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，形成細胞球體增多，成球率達29.70%±6.21%，而原代貼壁細胞的成球率為3.30%±1.49%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=-13.052，P＜0.05)。

圖1 胃癌細胞株MKN45在無血清培養(yǎng)條件下第21天所形成的懸浮球體

2.2 球體細胞中干細胞相關基因CD44的表達 定量PCR顯示，球體細胞中干細胞相關基因CD44mRNA的相對含量為1.18±0.04，原代貼壁細胞中干細胞相關基因CD44mRNA的相對含量為1.00±0.05，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（t=-4.386，P＜0.05）。免疫印跡分析顯示球體細胞的CD44的表達高于原代貼壁細胞（圖2）。

圖2 免疫印跡分析檢測CD44在原代貼壁細胞及球體細胞中的表達

3 討 論

目前針對CSCs分離、鑒定有各種不同的方法。有學者利用CSCs表面特異性標志物的熒光激活細胞分選法，這些標志物主要有 CD44、CD133 等[4，6-7]。也有學者利用ABCG2高表達的細胞具有將DNA熒光染料Hoechst 33342排出細胞外的特性，通過流式細胞術分選出邊緣細胞群[8-10]。還有學者采用懸浮球體培養(yǎng)法，候選細胞在含成纖維生長因子及表皮生長因子的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，能形成懸浮球體的細胞被認為是CSCs[11]。懸浮球培養(yǎng)法正是利用腫瘤干細胞的特性分離鑒定CSC的一種方法。文獻報道懸浮球培養(yǎng)法已在許多實體腫瘤中成功分離、鑒定出CSC[12-14]。而應用于胃癌干細胞的分離、鑒定的相關研究報道較為罕見。本研究選用胃癌細胞株MKN45在含人成纖維生長因子及表皮生長因子的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，結果顯示有一小部分細胞能夠形成懸浮球體。且懸浮球體細胞在無血清培養(yǎng)條件下，成球率明顯高于原代貼壁細胞，提示懸浮球體細胞富集具有自我更新與增殖的能力的胃癌干細胞。

為了進一步證實懸浮球體細胞的干細胞特性，本研究對胃癌細胞株MKN45懸浮球體細胞中的干細胞相關因子CD44作了檢測。CD44是一種多功能的跨膜糖蛋白，在許多正常組織細胞及腫瘤組織中都有不同程度表達[15]，也是在實體腫瘤中最早用來分離鑒定CSC的標志物之一。2009年Takaishi等[16]采用CD44作為特異性的分子標志物，分離鑒定胃癌干細胞。Lu Cao等[17]在干細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)肝癌細胞株PLC/PRF/5，結果PLC/PRF/5能夠形成無粘附的3-D球體。免疫印跡檢測顯示球體細胞中的肝CSC中的CD44,Oct3/4等相關蛋白，明顯高于原代貼壁細胞。張波等[18]在體外無血清培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)前列腺癌PC-3細胞，通過傳代更新、誘導分化驗證了PC-3懸浮成球細胞具有較強的增殖、自我更新及分化潛能。

本研究對胃癌細胞株MKN45球體細胞及原代貼壁中的CD44mRNA，采用逆轉錄聚合酶鏈反應和免疫印跡分析法檢測。結果顯示，盡管原代貼壁細胞中的CD44mRNA也有一定量表達，但球體細胞中CD44mRNA的表達仍高于原代貼壁細胞。進一步證實胃癌細胞株MKN45在無血清的培養(yǎng)液中，形成的懸浮球體細胞中富集類腫瘤干細胞。原代貼壁細胞中的CD44mRNA一定量的表達提示，CD44并非胃癌干細胞唯一的特異性標志物，如何聯(lián)合其他分子標志物進一步篩選、純化胃癌干細胞將是今后研究的方向。

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