孫華　王春燕　宋楊　吳樹敬　張芮　馮守千　陳曉流　陳學森

摘 要： 【目的】研究克隆新疆紅肉蘋果 [Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck） Langenf] PGIP基因并進行原核表達，探討其抗病機制?！痉椒ā扛鶕?jù)Genbank 中已經(jīng)發(fā)表的‘金冠蘋果PGIP保守區(qū)域設計1對特異引物，以新疆紅肉蘋果葉片總RNA為模板，T/A克隆后進行序列測定，并對該序列進行分析。隨后將該蛋白成熟肽cDNA片段連接到原核表達載體pET30a（+）中，構(gòu)建融合表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）中進行表達。【結(jié)果】序列分析表明，新疆紅肉蘋果PGIP基因cDNA編碼區(qū)全長993 bp，編碼330 個氨基酸殘基，命名為MsPgip，GenBank登錄號為JQ001783。MsPgip分子質(zhì)量為36.6 kD，等電點為7.05，有6個潛在的N-糖基化位點，信號肽為N端24個氨基酸殘基。該蛋白質(zhì)還具有2個連續(xù)的24個氨基酸殘基大小的LRR基序（LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRNKLTGHIPIS）。與已克隆的‘澳洲青蘋、‘金冠、‘富士蘋果PGIP氨基酸序列同源性均高達99%。原核表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明，表達蛋白的分子質(zhì)量與預期一致?！窘Y(jié)論】克隆了新疆紅肉蘋果PGIP基因，并可在大腸桿菌中表達。

關鍵詞： 新疆紅肉蘋果； 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白； 基因克隆； 表達

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0001-07

探討病害形成及抗病機理、培育抗病品種是果樹病害科學防控最經(jīng)濟有效的途徑之一。我國北方落葉果樹常見的真菌性病害主要有輪紋病、腐爛病、炭疽病、白粉病、黑星病等，這些病害不僅危害果樹的根、莖、葉，也危害果實[1]。真菌入侵植物時，必須首先穿越植物細胞壁，以啟動和擴大感染，真菌可分泌一系列的酶來降解植物細胞壁，而內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（Endo-polygalacturonases，Endo-PGs）是真菌首先分泌的細胞壁降解酶。植物產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting proteins，PGIPs）能夠與病原菌的PGs專一、可逆的結(jié)合，形成一種高親和復合物，從而抑制病原菌PGs的活性，并使具有生物活性的寡聚半乳糖醛酸苷（oligogalacturonides，OGs）的穩(wěn)定期相對延長，從而引發(fā)多種防衛(wèi)反應，增強植物抗性[2]。

新疆野蘋果（或塞威士蘋果，Malus sieversii Roeml）為伊犁野果林的建群種，是第三紀孑遺物種，同時也是現(xiàn)代栽培蘋果（Malus domestica Borkhl）的祖先種，十分珍貴[3]。盡管國家已在伊犁地區(qū)建立了新疆野蘋果自然保護區(qū)，但由于農(nóng)田開發(fā)及過度放牧等原因，導致新疆野蘋果資源正遭到嚴重破壞，群落面積急劇減少，保護這一寶貴種質(zhì)資源迫在眉睫。為此，本課題組在對新疆野蘋果形態(tài)、化學成分（糖、酸及香味與酚類物質(zhì)組分以及礦質(zhì)元素含量等）、分子系統(tǒng)學等多個層面進行了系統(tǒng)評價的基礎上，研究建立了核心種質(zhì)構(gòu)建及離體超低溫保存技術(shù)體系，構(gòu)建了新疆紅肉蘋果與‘紅富士等栽培蘋果品種雜種F1分離群體，已定植雜種實生苗4萬余株，研究發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果在表型與分子層面均存在豐富的遺傳多樣性，是進行蘋果功能成分育種的重要基因庫，并已從F1群體中選育出一批功能成分含量高的紅肉蘋果新品系[4-6]；胡小平等[7-8]對蘋果種質(zhì)資源抗黑星病特性進行的鑒定結(jié)果表明，15個參試蘋果種質(zhì)可被劃分高度抗病、中度抗病、中度感病及高度感病4種類型，其中新疆野蘋果和‘秦冠為高度抗病品種，其抗病性表現(xiàn)在抗侵入和抗擴展兩個方面，但有關新疆野蘋果抗病的分子機理至今未見研究報道。為此，我們以新疆紅肉蘋果為材料，進行PGIP基因的克隆及原核表達，旨在為進一步的蘋果抗病分子機理研究提供基本資料，并為新疆野蘋果資源的有效保護與利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試材

試驗于2010—2011年在山東農(nóng)業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室和山東農(nóng)業(yè)大學泰安橫嶺果樹育種基地進行，供試材料為新疆紅肉蘋果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana）‘夏紅肉4 a生嫁接苗，取新鮮葉片帶回實驗室，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

以新疆紅肉蘋果新鮮幼葉為材料，采用大連寶生物公司的Trizol試劑提取該組織總RNA，進行RNA質(zhì)量和濃度檢測后取1 μg的總RNA用于cDNA第1鏈的合成。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中公布的‘金冠蘋果PGIP基因的保守序列和原核表達載體pET30a（+）多克隆酶切位點，設計特異引物。MsPgip-F： 5′-CTGGATCC ATGGAACTCAACT-CAAGTTCTCC-3′，MsPgip-R： 5′-TTGTCGACTTACTTGCAGCTTGGGAG-3′。在上下游引物的5′端分別加入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點及保護堿基（下劃線部分為酶切位點，斜體部分為保護堿基）。

1.4 PGIP基因的克隆

參照大連寶生物公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。

以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR條件： 94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。參照索來寶多功能凝膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物。回收產(chǎn)物與pMD18-T-simple載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，PCR確認后送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。重組質(zhì)粒命名為pMD-MsPgip。

1.5 生物信息學分析

利用NCBI網(wǎng)站上的BLASTn程序進行同源序列比對；DNAMAN軟件分析ORF，推導氨基酸序列，預測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點、親水性與疏水性，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；SignalP 3.0Server預測信號肽。

1.6 MsPgip基因在大腸桿菌中的表達

根據(jù)克隆的MsPgip序列以及原核表達載體pET30a（+）多克隆酶切位點序列，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD-MsPgip和原核表達載體pET30a（+），分別回收插入的目的片段和表達載體，將2者按照摩爾比1∶3混合后，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，隨機挑取陽性克隆測序。同時，依照北京索來寶科技有限公司的DNA質(zhì)粒小提試劑盒說明書進行提取質(zhì)粒DNA，然后進行酶切鑒定。融合表達重組質(zhì)粒命名為pET-MsPgip。

重組質(zhì)粒pET-MsPgip轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取抗性單菌落接種于2 mL液體LB培養(yǎng)基（含100 mg·L-1卡那霉素）37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新的液體LB培養(yǎng)基中（含100 mg·L-1卡那霉素）37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h（OD600大約為0.5），隨后加入異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）誘導劑（終濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol·L-1）進行誘導表達。同時以pET-30a（+）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌加IPTG（終濃度1 mmol·L-1）誘導為正對照，以未加IPTG誘導的重組質(zhì)粒為負對照。誘導2 h后收集菌體。菌體中加入菌液體積10%的1×SDS-PAGE 上樣緩沖液（50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 6.8），2% SDS， 0.1%溴酚藍，10%甘油，1% DDT），100 ℃煮沸5 min，立即冰浴2 min，最大轉(zhuǎn)速離心5 min，取20 μL樣品（即為總蛋白）上樣，進行SDS-PAGE（5%濃縮膠和10%分離膠）電泳分析。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色并脫色至背景清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsPgip的克隆和序列分析

以紅肉蘋果葉片cDNA為模板進行RT-PCR，獲得了預期大小的單一條帶。將該片段連接到pMD18-T-simple載體后測序，結(jié)果表明，該基因的讀碼框（ORF）為993 bp。命名為MsPgip，GenBank登錄號為JQ001783。MsPgip基因編碼330個氨基酸（圖1）。其中，酸性氨基酸32個，占9.7%，堿性氨基酸32個，占9.7%。分子質(zhì)量約為36.6 kD，等電點為7.05。將該基因編碼的氨基酸序列分別采用隱馬爾科夫模型和神經(jīng)網(wǎng)絡方式進行信號肽預測， 結(jié)果均表明該蛋白質(zhì)信號肽為N端的24個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)裂解點位于第24位絲氨酸（ Ser） 與第25位天冬氨酸（ Asp） 殘基之間。蛋白質(zhì)親水性和疏水性分析表明，該蛋白質(zhì)N 端24 個氨基酸殘基構(gòu)成一明顯的疏水區(qū)域，這與信號肽預測結(jié)果相吻合。此外，其N端含有6個潛在的糖基化位點，N端和C端分別含有5個、4個參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。序列保守性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)還具有2個連續(xù)的24個氨基酸長的LRR基序 （LSQLKNLTFLDLS FNNLTGAIPSSLSQLPNLNALHLDRNKLTGHIPIS）。這是多數(shù)植物抗病基因PGIP表達蛋白特有的保守序列。

2.2 MsPgip同其他PGIPs的比較

將MsPgip與GenBank中登陸的其他PGIPs基因氨基酸序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2）。結(jié)果顯示，MsPgip同薔薇科類PGIPs具有很高的同源性，如： 與桃84%、美洲李85%、湖北海棠97%、西洋梨98%。從進化關系來看，新疆紅肉蘋果同‘澳洲青蘋、‘金冠、‘富士、湖北海棠、西洋梨聚在一起，同玉米、大豆、擬南芥關系甚遠。

MsPgip與‘澳洲青蘋、‘富士、‘金冠PGIP的氨基酸序列同源性均高達99%，只有3個氨基酸不同（圖3）。‘澳洲青蘋、‘富士、‘金冠氨基酸序列第7、185、218位點分別是I（異亮氨酸）、K（賴氨酸）、T（蘇氨酸），而新疆紅肉蘋果氨基酸序列第7、185、218位點分別是T（蘇氨酸）、I（異亮氨酸）、G（甘氨酸）。

2.3 MsPgip在大腸桿菌中的表達

2.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及重組子的鑒定 提取pMD-MsPgip和pET30a（+）質(zhì)粒，同時用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收插入片段和表達載體，將2者按照摩爾比1∶3混合后，用T4 連接酶進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-MsPgip。用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET-MsPgip，可切出1 000 bp左右片段。為了進一步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，在酶切鑒定的基礎上，對重組表達質(zhì)粒pET-MsPgip進行了序列測定。序列測定結(jié)果表明，連入表達載體pET30a（+）中的基因片段與目的序列一致，并且酶切位點連接處序列也正確，未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象。表明已獲得了正確的MsPgip的原核表達重組質(zhì)粒。

2.3.2 SDS-PAGE分析 重組質(zhì)粒pET-MsPgip在大腸桿菌BL21（DE3）中通過IPTG誘導融合表達。結(jié)果表明，在37.6 kD（含標簽大?。┳笥椅恢糜心康牡鞍椎娜诤媳磉_條帶（圖4），表達的融合蛋白分子量大小與理論預測值相符，而正負對照在37.6 kD左右均未有表達，這說明融合蛋白在E. coli BL21（DE3）中成功表達。

經(jīng)過不同濃度IPTG誘導培養(yǎng)后，目的融合蛋白在不同濃度下表達量變化沒有顯著差異。表明 IPTG 濃度對融合表達載體pET-MsPgip表達水平影響不大。

3 討 論

提質(zhì)增效是我國蘋果產(chǎn)業(yè)的主旋律，圍繞這一主題，一方面要進一步加強品質(zhì)育種，同時要瞄準國際蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展前沿，研究建立適應中國國情的現(xiàn)代蘋果栽培模式，即良種與良法配套[4]。選育并推廣抗病蘋果品種，可有效減少農(nóng)藥的使用量，是提質(zhì)增效的重要途徑之一；已有的研究結(jié)果表明，新疆野蘋果不僅富含多酚等功能成分，是進行蘋果功能成分育種的重要基因庫，而且高抗蘋果黑星病[5，7]。為此，進一步開展新疆野蘋果抗病分子機理研究，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)抗病蘋果新品種，對于新疆野蘋果這一珍貴資源的科學保護與有效利用以及我國蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展具有重要意義。

植物PGIP與病原真菌PGs相互作用是從分子水平上研究植物LRR介導特異識別的一種模式系統(tǒng)，而LRR是大多數(shù)植物抗病基因PGIP表達蛋白特有的重復序列[9]。PGIP通過LRR基序上暴露于外表面的氨基酸殘基來發(fā)揮其抑制PGs活性的作用[10]，這些暴露于外表面的氨基酸殘基發(fā)生突變則會嚴重影響其活性[11]；在果樹方面，目前已從梅、桃以及‘澳洲青蘋、‘金冠與‘富士蘋果品種中克隆得到了PGIP基因[12-14]，其中從3個蘋果品種中克隆得到的PGIP基因cDNA編碼區(qū)全長均為993 bp，編碼330個氨基酸殘基，都含有2個連續(xù)的24個氨基酸殘基大小的LRR基序。本研究以新疆紅肉蘋果為材料，從新鮮幼葉中克隆得到其PGIP基因。序列分析表明，新疆紅肉蘋果PGIP基因cDNA編碼區(qū)全長993 bp，編碼330個氨基酸殘基。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為36.6 kD，等電點為7.05，有6個潛在的N-糖基化位點，信號肽為N端24個氨基酸殘基。該蛋白質(zhì)還具有2個連續(xù)的24個氨基酸殘基大小的LRR基序。將本實驗克隆得到的新疆紅肉蘋果的PGIP氨基酸序列同‘澳洲青蘋、‘金冠與‘富士蘋果的PGIP氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，4者在139～186位點都含有2個連續(xù)的24個氨基酸長的LRR基序，所不同的是第185位點氨基酸殘基發(fā)生了突變，新疆紅肉蘋果為異亮氨酸（I），其他3個品種為賴氨酸（K）。新疆野蘋果是現(xiàn)代栽培蘋果的祖先種，在長期的進化過程中，3個栽培品種PGIP氨基酸序列在同一位置的突變導致PGIP活性發(fā)生了變化，抑制PGs能力下降，從而對黑星病的抗性降低。因此推測PGIP第185位氨基酸突變是導致‘澳洲青蘋、‘金冠與‘富士蘋果抗黑星病的能力下降以及新疆野蘋果對黑星病具有最高抗性的可能原因，有待進一步研究。

有研究表明，不同來源的PGIP其抑菌效果存在差異[15]，因此，在通過轉(zhuǎn)PGIP基因進行植物抗病育種前有必要進行體外抑菌試驗，大腸桿菌是最常用的外源基因表達宿主。本研究中MsPgip在大腸桿菌中成功表達，但其可溶性及抑菌效果如何有待驗證。因此有必要將得到的原核表達蛋白進行分離純化，進一步驗證其抑菌效果并進行真核生物表達研究，以便為蘋果抗病育種奠定基礎。

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