宮霞　王煥沖　楊勇　楊明摯

摘 要：【目的】探討葡萄科內(nèi)各屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為該科植物的研究提供分子系統(tǒng)學(xué)方面的資料?！痉椒ā恳云咸芽?4個(gè)屬共計(jì)103個(gè)樣品基于trnL-F的序列為材料，用Clustalx1.83軟件分析各屬的分子特征；并以五椏果屬（Dillenia L.）為外類(lèi)群，分別使用Mega，Paup，Phylip 常用的系統(tǒng)分析軟件進(jìn)行葡萄科各屬間的分子系統(tǒng)學(xué)研究?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，在GC含量方面，火筒樹(shù)屬含量最高，為35.12 %～35.44%，葡萄屬含量最低，為32.98%～33.63%；葡萄科各屬的trnL-F序列間存在著不同的序列差異，部分屬具有顯著的分子特征，可用于屬間鑒定?！窘Y(jié)論】應(yīng)用Mega、Phylip和Paup系統(tǒng)分析軟件的聚類(lèi)結(jié)果表明，3種軟件分析均支持將葡萄科分為5個(gè)分支，而其中Paup和Phylip軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)較符合葡萄科基于形態(tài)學(xué)的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 葡萄科； TrnL-F序列； 分子特征； 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0028-09

葡萄科（Vitaceae）植物多為木質(zhì)藤本，在白堊紀(jì)時(shí)期就已存在于地球，現(xiàn)在廣泛分布于全球各地。葡萄科植物分類(lèi)比較復(fù)雜，分類(lèi)學(xué)家對(duì)屬種的處理歷來(lái)有分歧，世界屬種數(shù)目隨研究者不同而不同，總結(jié)起來(lái)全科約有14～16屬700～850種[1]，其中我國(guó)有9屬150多種，各省均產(chǎn)，而野生種主要分布在華中、華南及西南各省[2]。葡萄科的系統(tǒng)學(xué)研究較少，該科的系統(tǒng)學(xué)位置尚不確定，即便是在葡萄科內(nèi)關(guān)于各屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也不十分清楚。

葉綠體基因組（Choroplast DNA，cpDNA），其遺傳方式為單親遺傳，具有較高的序列保守性，進(jìn)化速率恒定等優(yōu)點(diǎn)。TrnL-F序列是葉綠體基因組之一，該片段大小適中，不受功能限制，其進(jìn)化速率大于功能編碼區(qū)，能提供較多系統(tǒng)學(xué)意義的信息位點(diǎn)，在大麥屬[3]，川續(xù)斷目[4]等的系統(tǒng)學(xué)研究上已取得成功。因此被認(rèn)為適應(yīng)于研究植物屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在眾多的生物分析軟件中，Mega、Paup和Phylip軟件常被用于系統(tǒng)發(fā)育的分析中。用Paup軟件分析葡萄科[5-6]、傘形科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[7]；用Mega軟件分析葫蘆科[8]、繁縷及其近緣種的親緣關(guān)系分析[9]；用Phylip軟件分析桫欏科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[10]。我們選取這3種較常用的軟件，基于葡萄科14個(gè)屬植物的TrnL-F序列，研究葡萄科內(nèi)屬間關(guān)系并篩選出較適合葡萄科系統(tǒng)分析的TrnL-F 序列，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

以屬名拉丁文在GeneBank上檢索，得到葡萄科14個(gè)屬103條trnL-F序列，并選取五椏果科五椏果屬（Dillenia L.）1條序列為外類(lèi)群，總計(jì)104條序列（表1）。

對(duì)收集到的共計(jì)104條樣品序列用Clustalx1.83軟件進(jìn)行完全比對(duì)，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜斯ばＵ?。排序后的序列分別使用Mega5、Paup4.0b4a和Phylip軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。均采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，各分支的置信度用自展檢驗(yàn)法（bootstrap test）檢驗(yàn)，共進(jìn)行500次循環(huán)，以評(píng)價(jià)各支的系統(tǒng)學(xué)意義和可靠性。建立系統(tǒng)樹(shù)時(shí)，始終以D. turbinata為外類(lèi)群，空位（gap）始終作為缺失（missing）處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于TrnL-F序列的葡萄科各屬間的分子特征

所有序列經(jīng)Clustalx1.83軟件比對(duì)完后，計(jì)算所有序列的G+C含量，其中以火筒樹(shù)屬平均含量最高，為35.12%～35.44%，葡萄屬平均含量最低，為32.98%～33.63%。

比對(duì)結(jié)果顯示，屬與屬之間存在著各自特定的序列差異。既有單個(gè)堿基的差異，又有多個(gè)堿基的差異。Cyphostemma屬與其余屬相比，差異部位較多，共計(jì)28處，其次是火筒樹(shù)屬。而酸蘞莓屬較特殊，尚未發(fā)現(xiàn)該屬內(nèi)部序列共有的差異位點(diǎn)。部分屬的差異位點(diǎn)具有明顯的特異性。如葡萄屬有四段較大的序列缺失，分別是645-655處缺失“CTCTTTTCGTT”， 657-668處缺失“GCGGTTCAAAAT”，685-700處缺失“ATGTTTATCATTCACT”和719-730處缺失“AAAGGGATCCGC”。Cyphostemma屬與其他屬的差異位點(diǎn)較多，且缺失片段較大，如807～841處缺失“GATACGCGTACAAACGAACATCTTTGAGCAAGGA A” 和847～879處缺失“TCTTCATTTGAATGATTCA CAGTACATATCATT”等。不僅存在單個(gè)屬特異的突變位點(diǎn)，還有多屬共有一個(gè)差異位點(diǎn)的現(xiàn)象。例如，烏蘞莓屬和崖爬藤屬共有6處相同變異，其中5處又與Cyphostemma屬變異相同。這種明顯的序列特征或許可以在今后的植物鑒定上發(fā)揮作用。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化

所得序列分別用Mega5、Paup4.0、Phylip軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以大花五椏果（D. turbinata）為外類(lèi)群（圖1～3）。可見(jiàn)，葡萄科所有序列為單起源，聚在一個(gè)分支上。在3種軟件所建樹(shù)中，大部分序列是以屬為單位結(jié)合在一個(gè)分支上，整體上可以分為五大分支：火筒樹(shù)屬分支；地錦屬-俞藤屬分支；蛇葡萄屬-Clematicissus屬-Rhoicissus屬分支；白粉藤屬-烏蘞莓屬-崖爬藤屬-Cyphostemma屬分支；酸蘞莓屬-葡萄屬-Nothocissus屬-Pterisanthes屬分支。

2.2.1 火筒樹(shù)屬分支 火筒樹(shù)屬，直立喬木或灌木，無(wú)卷須，花瓣基部聯(lián)合并且與不育雄蕊管貼生。這些形態(tài)學(xué)特征與葡萄科的攀援木質(zhì)藤本，有卷須等特征存在明顯不同。因此有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)將火筒樹(shù)屬?gòu)钠咸芽浦蟹蛛x出來(lái)，獨(dú)立成科[1，5，11-14]。然而，該屬花兩性，排列成聚傘花序，胚乳呈嚼爛狀等形狀與葡萄科基本特征相似，故有學(xué)者將其歸于葡萄科內(nèi)[2]。

3種軟件中火桐樹(shù)屬的聚類(lèi)結(jié)果是一致的，火筒樹(shù)屬單獨(dú)聚在一個(gè)分支上，為單起源。不與葡萄科其他屬交叉，亦和五椏果科保持獨(dú)立。該支支持度很高，均為96%以上。圖1中火筒樹(shù)屬與蛇葡萄屬聚集，支持火筒樹(shù)屬放在葡萄科內(nèi)。

2.2.2 地錦屬-俞藤屬分支 俞藤屬，1990年建立的一個(gè)新屬[15]，僅含3種，過(guò)去一直將該屬放在地錦屬中[11]，Soejima等[5]研究葡萄科3種序列構(gòu)建的樹(shù)中，將地錦屬與俞藤屬放在同一分支上，也有少數(shù)學(xué)者將其歸到烏蘞莓屬中。從光學(xué)顯微鏡下觀察俞藤屬和地錦屬的表皮特征差異不大[1]，但在形態(tài)學(xué)上，俞藤屬植物卷須二叉分枝，顯著伸長(zhǎng)，卷須頂端不膨大呈吸盤(pán)，而地錦屬植物是卷須多總狀多分支，遇到附著物后膨大成吸盤(pán)；俞藤屬植物花序與葉對(duì)生，呈典型的復(fù)二歧聚傘花序，種子腹面兩側(cè)洼穴自基部向上達(dá)種子2/3處；而地錦屬植物花呈多岐聚散花序，種子腹面兩側(cè)洼穴呈溝狀從基部向上斜展到達(dá)種子頂端[2]。

地錦屬在3種軟件聚類(lèi)結(jié)果中均分成兩支，一支由來(lái)自亞洲的地錦種組成，與蛇葡萄屬親緣關(guān)系較近，支持度為69%；另一支由來(lái)自北美洲的地錦種組成，圖1中這支與馬來(lái)西亞的Ampelocissus filipes關(guān)系較近，圖2和圖3中與葡萄屬聚在一支上，支持度較低。俞藤屬由亞洲種組成，與地錦屬分離，在圖1中與第5分支聚在一起，圖2、圖3中，俞藤屬均由地錦屬的亞洲種分支分生而來(lái)。Paup和Phylip軟件建樹(shù)結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征更相符，因此在分子系統(tǒng)學(xué)上支持俞藤屬的獨(dú)立。

2.2.3 蛇葡萄屬-Clematicissus屬-Rhoicissus屬分支 Clematicissus屬與Rhoicissus屬是由Planchon等[11]于1887年首先提出的。Clematicissus屬主要分布于澳大利亞西部，多年生落葉灌木，卷須二叉分枝，聚傘花序，花盤(pán)杯狀，花柱呈錐形，具有塊莖。Rhoicissus屬是非洲的一個(gè)小屬，植株較為瘦小，芽球狀，其花序?yàn)榫蹅慊ㄐ?，常有卷須，花兩性或假兩性，花瓣脫落時(shí)仍聯(lián)合，但花盤(pán)貼生于子房上。

該支可分成三小支，Clematicissus屬與Rhoicissus屬各成一支，后與蛇葡萄屬聚為一支，這一支在3種軟件聚類(lèi)結(jié)果中基本一致。

2.2.4 白粉藤屬-烏蘞莓屬-崖爬藤屬-Cyphostemma分支 Cyphostemma屬主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，常具羽狀或3出復(fù)葉，花序腋生或近頂生，花芽瓶狀，花盤(pán)具4個(gè)蜜腺，花柱不裂等特點(diǎn)。白粉藤屬是葡萄科最早建立的兩個(gè)屬之一[2]，是葡萄科中較大的屬。Soejima等[5]認(rèn)為白粉藤屬與非洲的Rhoicissus屬距離較近，但在本研究中并沒(méi)有體現(xiàn)出來(lái)?，F(xiàn)已有很多研究支持烏蘞莓屬與崖爬藤屬分支[5，14，16]。

白粉藤屬獨(dú)立于該支其余序列，且與葡萄屬親緣關(guān)系較近。崖爬藤屬與Cyphostemma屬均從烏蘞莓屬的一支中分離而來(lái)。烏蘞莓屬在圖1中分成兩支；圖2和圖3中分三支，一支僅含有崖爬藤屬，Cyphostemma屬和部分烏蘞莓屬序列，另外兩支是全部由烏蘞莓屬序列組成，與前一分支并列成姐妹分支。是否存在長(zhǎng)期的地理隔離導(dǎo)致性狀的不同，而形成新屬，還有待進(jìn)一步研究。

2.2.5 酸蘞莓屬-葡萄屬-Nothocissus屬- Pterisanthes屬分支 Nothocissus屬分布于亞洲，是一個(gè)較小的屬。Pterisanthes屬是分布于馬來(lái)西亞，菲律賓等東南亞地區(qū)，其特點(diǎn)是具有扁平帶狀的圓錐花序，花序與葉對(duì)生，卷須分叉，2者均生于花梗處。酸蘞莓屬分布于亞洲南部、非洲、大洋洲和中美洲。Wen等[17]研究葡萄科GAI1基因得出結(jié)論，在沒(méi)有得到Nothocissus屬序列時(shí)，酸蘞莓屬與Pterisanthes屬距離較近。在葡萄科，葡萄屬的起源問(wèn)題存在較大爭(zhēng)議，多數(shù)研究指明葡萄屬為單起源屬，而Ingrouille等[14]從rbcL序列方面研究認(rèn)為葡萄屬是多起源屬。本文3種樹(shù)都支持葡萄屬為多起源。

該支在3種樹(shù)中支持度都很低。Pterisanthes屬并沒(méi)有聚成一支，Nothocissus屬與酸蘞莓屬親緣關(guān)系較近。圖1中酸蘞莓屬與Nothocissus屬、Pterisanthes屬、葡萄屬部分序列混雜排列在一支。圖2和圖3中除葡萄屬有少數(shù)序列與白粉藤屬聚在一起，其余酸蘞莓屬與葡萄屬均按屬各自聚成一支。

3 討 論

本文運(yùn)用Mega5、Paup4.0、Phylip 3種軟件對(duì)葡萄科14屬103條trnL-F序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，從親緣關(guān)系上大致可分為5大分支：火筒樹(shù)屬分支；地錦屬[18]-俞藤屬分支；蛇葡萄屬-Clematicissus屬-Rhoicissus屬分支；白粉藤屬-烏蘞莓屬-崖爬藤屬[19]-Cyphostemma屬分支；酸蘞莓屬-葡萄屬-Nothocissus屬-Pterisanthes屬分支。

在分子系統(tǒng)學(xué)方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)葡萄科親緣關(guān)系的研究結(jié)果并不一致。Rossetto等[20]對(duì)澳大利亞葡萄科三屬26個(gè)種trnL內(nèi)含子序列的研究認(rèn)為崖爬藤屬是單系群，而烏蘞莓屬的2個(gè)姊妹群、白粉藤屬和葡萄（V. vinifera）則為一個(gè)多系群；Rossetto等[21]對(duì)葡萄科四屬8個(gè)種EST-SSRs標(biāo)記結(jié)果表明，烏蘞莓屬和崖爬藤屬親緣關(guān)系較近，白粉藤屬則和葡萄親緣關(guān)系較近；Wen等[17]以火筒樹(shù)屬（Leea L.）為外類(lèi)群，對(duì)葡萄科10屬103條核GAL1系統(tǒng)發(fā)育分析表明，親緣關(guān)系為烏蘞莓屬-崖爬藤屬-Cyphostemma屬分支，葡萄屬-酸蘞莓屬（熱帶）-Pterisanthes屬分支，地錦屬-俞藤屬分支，酸蘞莓屬（亞洲）-Pterisanthes屬（東南亞），其中蛇葡萄屬分羽狀、掌狀兩亞支，與白粉藤屬（C. striata complex）、Rhoicissus屬（非洲）為并系群，白粉藤屬（C. striata complex除外）則為單系群。

對(duì)比這些研究結(jié)果，與本文最大的區(qū)別在于白粉藤屬和葡萄屬的系統(tǒng)學(xué)位置。差異的原因可能在于葉綠體基因在進(jìn)化方向的分析方面存在著一定的局限性[9]，如進(jìn)化速率遠(yuǎn)低于核基因組序列，再加上白粉藤屬本身又較為復(fù)雜，所以要確定白粉藤屬和葡萄屬的親緣關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

在形態(tài)系統(tǒng)學(xué)方面，基本是一個(gè)先發(fā)現(xiàn)鑒定、后糾正補(bǔ)充的趨勢(shì)。1936年，恩格勒系統(tǒng)將火筒樹(shù)屬置于葡萄科[2]，1997年Takhtajan則主張將其獨(dú)立成火筒樹(shù)科。1990年李朝鑾[2]將分布于中國(guó)亞熱帶、尼泊爾和印度卡西山區(qū)一些植物物種從地錦屬中分出單獨(dú)成為俞藤屬。其中俞藤屬和地錦屬雄蕊5枚，花盤(pán)發(fā)育不明顯，而酸蘞莓屬的雄蕊4～5，花盤(pán)發(fā)達(dá)[2]，可見(jiàn)俞藤屬與地錦屬親緣關(guān)系較近；而白粉藤屬和烏蘞莓屬卷須不分枝或2～3叉分枝，稀總狀多分枝，花4數(shù)，花瓣各自分離脫落，而葡萄屬花5枚，花瓣凋謝時(shí)呈帽狀粘合脫落，種子2～4顆[2]，可見(jiàn)白粉藤屬與烏蘞莓屬親緣關(guān)系較近。任輝等[1]對(duì)葡萄科11屬37個(gè)代表種葉表皮氣孔類(lèi)型觀察，發(fā)現(xiàn)地錦屬、俞藤屬、葡萄屬、蛇葡萄屬、Muscadinia和酸蘞藤屬特征相似，烏蘞莓屬、Rhoicissus、白粉藤屬和崖爬藤屬特征相似。

對(duì)比3種軟件建樹(shù)的結(jié)果，最大的區(qū)別在于俞藤屬和白粉藤屬的系統(tǒng)位置。Paup和Phylip軟件建樹(shù)結(jié)果較為符合葡萄科形態(tài)學(xué)上的特征，更適合用于葡萄科系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

參考文獻(xiàn) References：

[1] REN Hui，PAN Kai-yu，CHEN Zhi-rui，WANG Ren-qing. Structural characters of leaf epidermis and their systematic significance in Vitaceae[J]. Acta Phytotaxonomica Sinica，2003，41（6）： 531-544.

任輝，潘開(kāi)玉，陳之端，王仁卿. 葡萄科植物葉表皮特征及其系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 植物分類(lèi)學(xué)報(bào)，2003，41（6）： 531-544.

[2] LI Chao-luan. Flora[M]. Beijing： Science Press，1998.

李朝鑾. 中國(guó)植物志[M]. 北京： 科學(xué)出版社，1998.

[3] NISHIKAWA T，SALOMON B，KOMATSUDA T，VOR BOTHMER R，KADOWAKI K-I. Molecular phylogeny of the genus Hordeum using three chloroplast DNA sequences[J]. Genome，2002，45： 1157-1166.

[4] ZHANG W H，CHEN Z D，LI J H，CHEN H B，TANG Y C. Phylogeny of the Dipsacales s.l. based on chloroplast trnL-F and ndhF sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，26： 176-189.

[5] SOEJIMA A，WEN J. Phylogenetic analysis of the grape family （Vitaceae） based on three chloroplast markers[J]. American Joumal of Botany，2006，93（2）： 278-287.

[6] ROSSETTO M，CRAYN DM，JACKES BR，CAROLYN P. An updated estimate of intergeneric phylogenetic relationships in the Australian Vitaceae[J]. Canadian Journal of Botany，2007，85： 722-730.

[7] NEVES SS，WATSON MF. Phylogenetic relationships in Bupleurum （Apiaceae） based on nuclear ribosomal DNA ITS sequence data[J]. Annals of Botany，2004，93： 379-398.

[8] JOBST J，KING K，HEMLEBEN V. Molecular evolution of the internal transcribed spacers （ITS1 and ITS2） and phylogenetic relationships among species of the family Cucurbitaceae[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，1998，9（2）： 204-219.

[9] ZHAO Hai-guang，ZHOU Jian-jian，CAO Shan-shan，ZHENG Yu-hong，SHAN Yu，XIA Bing. Analysis of interspecific relationship among Stellaria media and its related species based on ITS and trnL-F sequence differences[J]. Journal of Plant Resources and Environment，2009，18（1）： 1-5.

趙海光，周建建，曹珊珊，鄭玉紅，單宇，夏冰. 基于ITS和trnL-F 序列堿基差異的繁縷及其近緣種的親緣關(guān)系分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，18（1）： 1-5.

[10] WANG Ting，SU Ying-juan，ZHENG Bo，LI Xue-yan，CHEN Guo-pei，ZENG Qing-lu. Phylogenetic analysis of the chloroplast trnL intron and trnL-trnF intergenic spacer sequences of the Cyatheaceae plants from China[J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany，2003，11（2）： 137-142.

王艇，蘇應(yīng)娟，鄭博，李雪雁，陳國(guó)培，曾慶璐. 中國(guó)桫欏科植物葉綠體trnL內(nèi)含子和trnL-trnF基因間隔區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2003，11（2）： 137-142.

[11] PLANCHON J E. MONOGRAPHIE D E S AMP？魪LID？魪ES VRAIS. In： De Candolle AFPP， and De Candolle C （ed）， Monographiae Phanaerogamarum[M]. Paris： Masson，1887： 305-654.

[12] RIDSDALE C E. A revision of the family Leeaceae[J]. Blumea，1974， 22： 57-100.

[13] SHETTY BV，SINGH P. Vitaceae. In SINGH N P，VOHRA J N，HAJRA P K，SINGH D K. Flora of India. Botanical Survey of India[M]. India： Calcutta，2000： 246-324.

[14] INGROUILLE M J，CHASE M W，F(xiàn)AY M F，BOWMAN D，BANK M，BRUIJN A. Systematics of Vitaceae from the viewpoint of plastid rbcL DNA sequence data[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，2002，138： 421-432.

[15] LI Chao-luan. Yua C. L. Lia A new genus of Vitaceae[J]. Acta Botanica Yunnanica，1990，12（1）： 1-10.

李朝鑾. 俞藤屬-葡萄科一新屬[J]. 云南植物研究，1990，12（1）： 1-10.

[16] ROSSETTO M，JACKES B R，SCOTT K D，HENRY R J. Is the genus Cissus （Vitaceae） monophyletic？Evidence from plastid from and nuclear ribosomal DNA[J]. Systematic Botany，2002，27： 522-533.

[17] WEN J，NIE ZL，SOEJIMA A，MENG Y. Phylogeny of Vitaceae based on the nuclear GAI1 gene sequences[J]. Canadian Journal of Botany，2007，85： 731-745.

[18] NIE Z L，SUN H，CHEN Z D，MENG Y，MANCHESTER S R，WEN J. Molecular phylogeny and biogeographic diversification of Parthenocissus （Vitaceae） disjunct between Asia and North America[J]. American Journal of Botany，2010，97： 1342-1353.

[19] CHEN P T，CHEN L Q，WEN J. The first phylogenetic analysis of Tetrastigma （Miq.） Planch.， the host of Rafflesiaceae[J]. International Association for Plant Taxonomy，2011，60： 499-512.

[20] ROSSETTO M， JACKES B R，SCOTT K D，ROBERT J. HenryIntergeneric relationships in the Australian Vitaceae： new evidence from cpDNA analysis[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2001，48： 307-314.

[21] ROSSETTO M， MCNALLY J， HENRY R J. Evaluating the potential of SSR flanking regions for examining taxonomic relationships in the Vitaceae[J]. Theor Appl Genet，2002，104： 61-66.