曹尚銀 沈程清 曹達 薛華柏 謝深喜 李好先

摘 要： 【目的】為了探明鹽脅迫下棗蛋白表達的差異，【方法】以較耐鹽堿的‘七月鮮棗品種的扦插苗為材料，經(jīng)過臨界濃度（0.60%）的鈉鹽（NaCl）處理，取其葉片進行蛋白質(zhì)雙向電泳，經(jīng)ImageMaster 2D分析，【結(jié)果】結(jié)果表明，處理與對照之間總蛋白的整體分布模式非常相似，在pH 3～10和MW50～90 kD內(nèi)的蛋白點分布最多，處理與對照之間量變倍數(shù)大于1.5倍的差異點有26個，其中6個蛋白受脅迫上調(diào)， 20個蛋白受脅迫下調(diào)。在上調(diào)的蛋白質(zhì)點中，3個點受鹽脅迫誘導增加了近4倍，2個蛋白質(zhì)點相對豐度增加了2倍以上，表現(xiàn)出強烈的鹽誘導特性。說明他們可能在棗的抗鹽機制中發(fā)揮重要作用。在下調(diào)的蛋白質(zhì)點中，2個點相對豐度降低至對照的5倍左右，表現(xiàn)出強烈的鹽抑制特性，說明其可能是對鹽脅迫比較敏感的2個蛋白質(zhì)或多肽，并且在棗的抗鹽性機制中也發(fā)揮比較重要的作用?！窘Y(jié)論】在臨界濃度鈉鹽脅迫下，棗葉片蛋白質(zhì)表達有顯著差異。

關(guān)鍵詞： 棗； 鹽脅迫； 蛋白質(zhì)； 雙向凝膠電泳

中圖分類號：S665.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0043-05

土壤鹽漬化已經(jīng)成為制約世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素，鹽脅迫是影響植物生長、降低作物產(chǎn)量的重要因素。隨著溫室效應(yīng)引起的全球氣候變暖，使得部分地區(qū)環(huán)境持續(xù)惡化，預計到2050年全球?qū)⒂谐^50%的耕地會變得鹽堿化[1-2]。探索植物耐鹽機制，提高植物耐鹽性，開展耐鹽作物分子育種已成為一種有效的應(yīng)對措施[3]，這對減輕人類所面臨的土地資源和淡水資源短缺、糧食供需矛盾以及有效控制環(huán)境惡化都有著重要的戰(zhàn)略意義。

棗原產(chǎn)我國，已有7700余年的栽培歷史，較抗鹽堿、耐旱、耐瘠薄。棗果實營養(yǎng)豐富，含糖量居各類果品之首，維生素C的含量高于柑橘10倍，高于蘋果80倍，是梨的100倍。棗是我國優(yōu)勢果品，國外有30多個國家先后引種了我國的棗，但除韓國外均尚未形成規(guī)模化商品栽培，迄今98%的棗資源和100%的棗產(chǎn)品國際貿(mào)易集中在我國。目前我國的主要棗區(qū)大多是在過去不適宜耕作的山、沙、堿地區(qū)建立發(fā)展起來的。在河北、山東環(huán)渤金絲小棗產(chǎn)區(qū)和河南內(nèi)黃扁核酸棗區(qū)歷史上是著名的鹽堿區(qū)，形成上千公頃的棗林帶或林區(qū)，但產(chǎn)量較低，品質(zhì)較差。近年來，我國的新疆和沿海地區(qū)，在鹽堿地正探索大面積發(fā)展棗樹生產(chǎn)。如何提高棗樹的耐鹽性已成為我們亟待研究的重大問題[4]。這不僅關(guān)系到提供棗產(chǎn)量和品質(zhì)，更關(guān)系到國內(nèi)外棗產(chǎn)品的供應(yīng)，我國民族果樹的振興，關(guān)系到數(shù)百萬棗農(nóng)的小康生活，關(guān)系到鹽堿地的綜合治理與開發(fā)。

當前，關(guān)于棗樹耐鹽性的研究主要集中于生態(tài)學和生理生化特性研究[4]，而其耐鹽性相關(guān)分子生物學研究，尤其是蛋白組學研究幾乎無人涉及。研究嘗試并確定了抗鹽性較強的‘七月鮮棗葉片雙向電泳體系，通過高通量的蛋白組學方法[5-6] ，分析棗耐鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白，為進一步研究鹽脅迫下棗葉片特異蛋白質(zhì)的功能及揭示棗耐鹽分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗在中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所棗良種圃進行，試驗材料為‘七月鮮棗當年生扦插苗。扦插苗屬于同一母樹上發(fā)育良好、無病蟲害及機械損傷的半木質(zhì)化枝條快繁而成。盆栽基質(zhì)為良種圃中普通土加草炭100 g·kg-1（干質(zhì)量，下同）和河沙50 g·kg-1，混勻、過篩。盆土基質(zhì)含有機質(zhì)0.98%、速效氮（N）0.0067%，速效磷（P）0.0033%，速效鉀（K）0.0115%，pH 7.12，含鹽量0.026%。栽植用塑料（PVC）盆，高33 cm，上口徑40 cm，下口徑33 cm，底部有排水孔，置于托盤上。每盆裝基質(zhì)7.12 kg（干質(zhì)量）。2009年3月12日每盆栽大小基本一致的3株棗苗， 每個處理3次重復，每個重復10盆，NaCl處理濃度為： 0， 0.60%（依文獻[4]試驗結(jié)果設(shè)計的超臨界濃度（0.60%）的鈉鹽，按基質(zhì)干質(zhì)量計），取相應(yīng)量NaCl加水至1 500 mL，一次澆入，自然光照避雨狀態(tài)下培養(yǎng)，每5 d根據(jù)土壤濕度補充等量自來水，有溶液滲出到托盤中，于2 h后返澆盆中。第25天分別采集每株苗木中部3枚成熟葉片用ddH2O沖洗干凈后迅速用濾紙輕輕擦干，稱質(zhì)量。

1.2 蛋白質(zhì)的提取與定量

棗總蛋白的提取方法參照本實驗室朱志勇等[7] 已經(jīng)建立的蘋果蛋白質(zhì)提取的方法，略有改動。切取棗葉組織，切碎成3 mm×3 mm的小塊，在液氮中，用研缽磨碎成細粉狀。將組織細粉轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入25 mL TCA/丙酮（1∶9），65 mmol·L-1 DTT，-20 ℃沉淀1 h。離心10 000 r·min-1，45 min，去除上清，沉淀加入25 mL純丙酮，-20 ℃沉淀1 h，離心10 000 r·min-1，45 min，去除上清，空氣干燥，-80 ℃保存。

稱取500 mg棗葉組織，加入0.5 mL全細胞裂解液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，65 mmol·L-1 Tris ，4% CHAPS，0.2%IPGbuffer），混均，超聲破碎細胞（冰?。ｋx心12 000 g，45 min，取上清，上清用0.22 μm過濾，獲得澄清溶液。上清采用Bradford法定量，100 μg分裝樣品，-80 ℃保存。

1.3 棗葉部蛋白質(zhì)雙向電泳及凝膠檢測

雙向電泳根據(jù)Bio-Rad公司的ProteomeWorksTMSystem中的方法進行。樣品制備后，用水化上樣緩沖液將樣品濃度稀釋為1 g·L-1，用于雙向電泳上樣。第1向等電聚焦采用pH 3～10，17 cm非線性的IPG預制膠條，對處理樣品分別取約含150 μg總蛋白的300 μL水化液，以主動水化上樣的方式上樣。等電聚焦程序設(shè)置為50 V， 14 h；250 V， 1 h；500 V， 1 h；1 000 V， 1 h；1 000～10 000 V線性上升5 h，10 000 V， 65 kVh；等電聚焦溫度為20 ℃。聚焦完畢后采用兩步平衡法，每步15 min。第2向電泳采用12% SDS-PAGE，在17℃循環(huán)水浴冷卻下進行。雙向電泳凝膠染色采用改良的銀染法[5]。

1.4 雙向電泳凝膠圖譜分析

雙向電泳凝膠圖象掃描采用GS800光密度掃描儀（Bio-Rad），用PDQuest8.0版軟件進行圖像分析，斑點檢測和匹配分析，找出差異蛋白。

1.5 作蛋白質(zhì)強度柱狀圖方法

以不同膠為x 軸，不同膠中某一個差異點的定量值信息為Y軸；以灰色豎線分割兩個組；藍色橫線表示該組內(nèi)蛋白的集中趨勢；紅色橫線表示該組內(nèi)蛋白的離散度； a、 b、c分別代表對照的統(tǒng)計學dispersion 極值；而a、b、 c矩形條代表對照蛋白點統(tǒng)計學定量在該范圍內(nèi)變化（即離散區(qū)間）。d、e、f 分別代表處理的統(tǒng)計學dispersion極值；而d、e、f矩形條代表處理蛋白點統(tǒng)計學定量在該范圍內(nèi)變化（即離散區(qū)間）。作蛋白質(zhì)強度柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗葉片可溶性蛋白質(zhì)提取率

配置考馬斯亮藍G-250蛋白質(zhì)顯色液，以標準蛋白質(zhì)BSA作蛋白質(zhì)濃度與OD值之間標準曲線。為了增加標準曲線的可靠性，不同濃度BSA標準品的光吸收值均設(shè)3次重復，pH調(diào)節(jié)到7.4（圖1）。

抽提蛋白中，蛋白質(zhì)提取率的高低是檢驗提取方法優(yōu)劣的主要指標之一。本研究采用Bradford法對蛋白進行定量，用牛血清白蛋白（BSA）制作標準曲線，蛋白濃度在0～100 g·L-1內(nèi)，R2=0.997 7。采用TCA丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)，在λ=595 nm時，檢測出棗葉片中蛋白平均濃度為11 g·L-1，其濃度較高，表明此蛋白提取方法較可靠，且為后續(xù)雙向電泳圖譜的清晰度、重復性奠定了基礎(chǔ)。此外，提高樣品中的蛋白濃度從而增加重泡漲液（水化緩沖液）的用量，能夠使樣品得到充分泡漲，第1向電泳的聚焦效果好，電壓能上升到8 000 V，但樣品蛋白濃度也不能過高，以不析出結(jié)晶為宜，否則亦會影響等電聚焦效果。

利用雙向電泳技術(shù)對‘七月鮮棗葉片的蛋白進行分離，為保證試驗的重復性，在相同條件下對2組樣品分別進行了3次重復性試驗（a、b、c為對照、d、e、f為0.6%NaCl處理過的‘七月鮮棗）。蛋白質(zhì)濃度均為11 g·L-1，其總蛋白的整體分布模式非常相似： 在pH 3～10和MW50～90 kD內(nèi)的蛋白點分布最多。其中檢測到a蛋白質(zhì)點為： 2 642個；b蛋白質(zhì)點為： 2 386個；c蛋白質(zhì)點為： 2 835個；d蛋白質(zhì)點為： 2 333個；e蛋白質(zhì)點為： 2 210個；f蛋白質(zhì)點為： 2 576個。銀染后獲得的原始二維凝膠圖譜結(jié)果如圖2。

2.2 氯化鈉脅迫下棗葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分析

經(jīng)掃描儀采集圖像后，用Image Master 2D圖像處理軟件進行了背景消除、污染點去除和放大檢測，共檢測出棗在鹽脅迫下26個蛋白質(zhì)點發(fā)生了變化，其中6個上調(diào)蛋白、20個下調(diào)蛋白（圖3）。

用蛋白質(zhì)強度柱狀圖信息顯示兩組樣品之間量變倍數(shù)大于1.5 倍差異點，26個受鹽脅迫影響而變化明顯的蛋白質(zhì)點中，6個受脅迫上調(diào)，上調(diào)蛋白分別是1 717、1 253、1 459、1 233、2 120、2 474；20個受脅迫下調(diào)，下調(diào)蛋白分別是2 443、2 496、2 498、287、2 543、2 288、2 550、1 896、1 418、1 527、1 526、1 374、1 362、1 438、 6 811、655、1 528、1 182、647、492。在上調(diào)的蛋白質(zhì)點中（圖4），1 459、2 474、1 233變化最大，與對照相比，受鹽脅迫誘導增加了4倍以上；其次是1 253和2 120 ，這2個蛋白質(zhì)點在鹽脅迫后相對豐度增加了2倍以上，表現(xiàn)出強烈的鹽誘導特性，說明他們可能在棗的抗鹽機制中發(fā)揮重要作用。在下調(diào)的蛋白質(zhì)點中，2 543、2 498受鹽脅迫抑制（圖4）最大，其相對豐度降低至不到對照的五分之一，表現(xiàn)出強烈的鹽抑制特性，說明2 543、2 498可能是對鹽脅迫比較敏感的2個蛋白質(zhì)或多肽，并且在棗的抗鹽性機制中也發(fā)揮比較重要的作用；其他受鹽脅迫抑制而相對豐度降低比較大（3倍以上）的蛋白質(zhì)點還有647、1 527、287、492（圖版）。

3 討 論

差異蛋白質(zhì)組學研究是目前蛋白質(zhì)組學研究的熱點之一。通過尋找某種特定因素所引起的細胞或組織的蛋白質(zhì)組變化，并對某些標志性蛋白進行定性和功能分析，揭示這些差異蛋白與特定生理、病理過程的相關(guān)性，從而探察細胞或機體對環(huán)境刺激的反應(yīng)及細胞調(diào)控的機制。通過獲取的蛋白質(zhì)樣品的表達譜信息來進行差異蛋白質(zhì)組研究為細胞信號調(diào)節(jié)、代謝途徑、增殖分化等基礎(chǔ)性生命科學研究提供了一個有效工具。生命科學研究已經(jīng)從基因組時代走入到了蛋白質(zhì)組時代，雖然，植物蛋白質(zhì)組學研究要明顯落后于醫(yī)學相關(guān)的蛋白質(zhì)組學研究的進程，但是，隨著植物基因組和表達序列標簽（EST）數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展，借助人類和動物模型研究獲得的方法，植物蛋白質(zhì)組學也越來越受到關(guān)注，并取得了一定的研究成果。紅海欖 （Rhizophora stylosa ）是一種典型的紅樹林鹽生植物。 范吉星等[8]研究利用差異蛋白組學技術(shù)對淡栽（R0）和 30 g·kg-1氯化鈉鹽栽（R3）處理后的紅海欖根部總蛋白進行了比較研究。 結(jié)果表明，在鹽水栽培上調(diào)的蛋白質(zhì)一般與逆境脅迫有關(guān)， 淡水栽培上調(diào)的蛋白質(zhì)一般與基本代謝有關(guān)。 這些研究結(jié)果為進一步研究紅海欖的耐鹽機制提供了有意義的線索。在高鹽脅迫下葡萄芽尖中 191 種蛋白質(zhì)表達豐度發(fā)生變化， 其中約 44%為具有同工型的蛋白質(zhì)， 且參與光合作用、 蛋白質(zhì)合成和定位的蛋白質(zhì)的表達豐度明顯下調(diào)[9]。1997年，Ramani等[10]。以水稻幼苗葉片為材料，利用體內(nèi)標記結(jié)合雙向電泳和放射性同位素自顯影技術(shù)，共檢測到52個蛋白質(zhì)與鹽脅迫有應(yīng)答關(guān)系。其中35個被鹽脅迫誘導，17個被鹽脅迫抑制，包括20個在這之前未曾報道的低豐度蛋白。這些發(fā)現(xiàn)對尋找鹽壓應(yīng)答新基因，尤其是那些在水稻鹽耐性獲得中起瞬時調(diào)節(jié)作用的基因十分重要。在本實驗中，以0.60%的鈉鹽（NaCl）處理‘七月鮮棗，結(jié)果表明，處理與對照之間蛋白質(zhì)量變倍數(shù)大于1.5倍的差異點有26個，其中6個蛋白受脅迫上調(diào)， 20個蛋白受脅迫下調(diào)。在上調(diào)的蛋白質(zhì)點中，3個點受鹽脅迫誘導增加了近4倍，2個蛋白質(zhì)點相對豐度增加了2倍以上，表現(xiàn)出強烈的鹽誘導特性，說明他們可能在棗的抗鹽機制中發(fā)揮重要作用。在下調(diào)的蛋白質(zhì)點中，2個點相對豐度降低至對照的5倍左右，表現(xiàn)出強烈的鹽抑制特性，說明其可能在棗的抗鹽性機制中發(fā)揮了比較重要的作用。關(guān)于鈉鹽脅迫后棗葉片中發(fā)生顯著變化的26個蛋白質(zhì)點的具體生物學功能還有待于質(zhì)譜鑒定以及進一步的、系統(tǒng)的功能解析研究。（本文圖版見封3）

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