萍　宗宇　劉晶　胡春云　滕元文

摘 要： 【目的】評價清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平，為其保護提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷?0對SSR引物，對清涼峰地區(qū)的36份三葉海棠樣品進行了遺傳多樣性分析，并從中隨機抽取6，9，12，15，18，27，34株大小不同的樣本，組成7個群體進行遺傳多樣性特征比較?！窘Y果】（1）10對引物在36份樣品中的多態(tài)性等位基因數(shù)（Na）平均值為7.1（5.0～10.0），有效等位基因數(shù)（Ne）平均值為3.954（1.527～5.786），平均觀察雜合度（Ho）為0.781（0.194～1.000），平均期望雜合度（He）為0.699（0.345～0.827），香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）平均值為1.458（0.662～1.918）；（2）采用UPGMA法構建的系統(tǒng)樹中，很明顯地將36份供試樣品劃分為兩組，與用貝葉斯聚類方法得到的結果一致，對三葉海棠所有樣品進行的主成分分析進一步證實了以上結果；（3）群體樣本量≥15株時，樣本量就不會對群體內(nèi)遺傳多樣性水平、遺傳一致度及群體內(nèi)等位基因數(shù)目產(chǎn)生明顯的影響?！窘Y論】清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平較高，其群體明顯分化為2個基因源，三葉海棠群體遺傳多樣性研究和種質(zhì)收集保存中的適宜樣本量為≥15株，研究供試樣品可以反映清涼峰地區(qū)三葉海棠遺傳多樣性的總體水平。

關鍵詞： 三葉海棠； SSR； 遺傳多樣性； 適宜樣本量

中圖分類號：S661.4 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0008-08

三葉海棠[Malus sieboldii（Regel）Rehd.]是薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus Mill.）的多年生木本植物，是重要的蘋果砧木資源[1]。世界地域范圍內(nèi)主要分布在中國、日本和朝鮮等地。在中國三葉海棠分布于從南到北的十多個省區(qū)[2]。位于浙江臨安和安徽績溪交界處的清涼峰地區(qū)，由于國家自然保護區(qū)的設立，保存了較完整的三葉海棠的自然居群[3]，但迄今為止還缺乏對其遺傳多樣性的評價。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用分子標記檢測植物的遺傳多樣性水平，在其他蘋果屬植物如小金海棠[4]、變?nèi)~海棠[5]、山荊子[6]、新疆野蘋果[7]、觀賞海棠[8]等都得到了應用。然而迄今為止，對三葉海棠的研究主要集中在其作為蘋果砧木的抗性生理[1]、營養(yǎng)成分和生物學特性[9]等方面。近年來，微衛(wèi)星熒光標記技術由于其高度智能化的特點，工作效率高，數(shù)據(jù)準確[10]，已經(jīng)廣泛應用到遺傳多樣性的研究中[11-12]。為此，研究運用微衛(wèi)星熒光標記技術，對清涼峰地區(qū)的36份三葉海棠樣品的遺傳多樣性進行分析，并從中隨機抽取6，9，12，15，18，27，34株不同大小的樣本量組成7個群體進行遺傳多樣性特征的比較，以期從DNA水平上分析該地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平，為今后更加合理地收集和保存三葉海棠種質(zhì)資源提供參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試的36份樣品采自位于浙江省臨安市與安徽省績溪縣交界的清涼峰地區(qū)的三葉海棠自然居群。于春季采集生長狀況良好植株的健康幼嫩葉片，按采集順序編號，放入裝有變色硅膠的自封塑料袋中，迅速干燥，帶回實驗室，用于DNA提取。為了使采集的樣品具有代表性和避免采集植株的遺傳一致性，從居群的某一植株開始，散射狀采集而且保證采集單株之間的間隔大于20 m。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用CTAB法[13]從硅膠干燥的葉片中提取總DNA，稀釋到10～30 mg·L-1，儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR標記 隨機抽取8個樣品的DNA用62對SSR引物進行擴增，將擴增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上60 W功率下電泳約2.5 h，電泳后銀染顯色。Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像儀（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）拍照記錄。從62對SSR引物中篩選出17對擴增條帶清晰穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物，因其中部分引物位于相同的連鎖群上，遺傳距離較近，所以對位于相同連鎖群的引物進行篩選，選出位于不同連鎖群的10對引物進行SSR擴增。篩選出的10對引物包括從蘋果屬植物中開發(fā)的7對基因組SSR引物： CH02D08、CH01F02、CH03G12、 CH02B10、CH01H01[14]、Hi21e04、Hi02f06[15]，2對EST-SSR引物： MES122、MES17[16]及梨屬中開發(fā)的基因組SSR引物KA14[17]（表1）。為了實現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性的熒光半自動檢測，對篩選好的引物進行熒光修飾，在單向引物的5端加上熒光修飾基團，熒光引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

PCR體系總體積為15 μL，其中包括模板DNA 10～20 ng，上、下游引物各0.4 μmol·l-1，dNTP 200 μmol·L-1， MgCl2 2.0 mmol·L-1，0.5 U Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）。PCR反應在Eppendorf公司的96孔Mastercycler Gradient PCR儀上進行，其中CH系列引物的反應程序為94 ℃預變性2.5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min共4個循環(huán)，每次循環(huán)后退火溫度降低1 ℃；然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[19]。KA系列引物的反應程序為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min共10個循環(huán)，每次循環(huán)后退火溫度降低0.5 ℃；然后94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共25個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[17]。其余引物的反應程序是94 ℃預變性3 min ，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃保存[16]。對PCR產(chǎn)物用滅菌后的雙蒸水稀釋，利用MegaBASE 1000測序系統(tǒng)（Amersham Biosciences）檢測并測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測序結果導入軟件Genetic Profile v 1.0（Molecular Dynamics），參照峰值強度及分子內(nèi)標的大小，確定微衛(wèi)星位點擴增片段的區(qū)間，對片段大小進行統(tǒng)計，對于出現(xiàn)多峰型的樣品，重新進行PCR試驗后再確定其片段大小，統(tǒng)計結果保存為Excel格式以備后續(xù)分析。

利用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GenAlEx 6.3[20]計算多態(tài)性等位基因數(shù)（Na），SSR位點的有效等位基因數(shù)（Ne），觀察雜合度（Ho），期望雜合度（He），固定指數(shù)（F）及香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）等遺傳多樣性指標。

使用NTSYS pc 2.10e軟件計算樣品的Jaccard遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA法建立36個供試樣品的親緣關系樹狀圖；并基于樣品間歐氏距離對36個樣品進行主成分分析（PCA）并進行二維作圖[21]。

使用STRUCTURE version 2.3.3進行貝葉斯聚類[22]，分析群體的遺傳結構并確定最佳的群體分組。首先設定K=1～5，設定Burn-in周期為100 000，MCMC的重復次數(shù)為100 000次，采用混合模型和相關等位基因頻率，對不同的K值進行10次重復運行，然后將后綴為“_f”的結果文件壓縮，上傳到“STRUCTURE HARVESTER”網(wǎng)站（http：//taylor0.biology.ucla.edu/ struct_harvest/），通過deltaK確定最佳K值[23]。

利用POPGENE version 1.31軟件進行三葉海棠不同大小群體量之間遺傳多樣性比較、稀有等位基因數(shù)目的計算以及聚類分析[24]。

2 結果與分析

2.1 群體內(nèi)遺傳多樣性及遺傳結構分析

2.1.1 SSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性 10對引物在36份樣品中的多態(tài)性等位基因數(shù)（Na）從5（CH02B10和KA14）到10（CH01F02），平均等位基因數(shù)為7.1（表2）。每份樣品每對引物產(chǎn)生2個相同（單峰）或不同（雙峰）的等位基因。有效等位基因數(shù)（Ne）從1.527（CH02B10）到5.786（CH01F02），平均值為3.954。本研究中觀察雜合度（Ho）為0.194～1.000，平均值為0.781。期望雜合度（He）為0.345～0.827，平均期望雜合度為0.699。Shannon香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）為0.662 ～1.918，平均值為1.458。而固定指數(shù)（F）只有在CH01F02、CH02B10以及MES17中為正值，其余均為負值，說明三葉海棠群體內(nèi)含有較多的雜合子。

2.1.2 聚類分析 基于SSR數(shù)據(jù)對36份供試樣品進行聚類分析，構建親緣關系樹狀圖（圖1）。從樹狀圖的分析可以得出： 在閾值0.60處，36份三葉海棠樣品被分成2組，其中A組包含20份樣品，而B組有16份樣品。在閾值0.79處，A組又被分成3個亞組，樣品1、13、14、32、33和35，樣品2、10、15、16、18、19、20、22、25、26、28、31和36分別聚成1個亞組，而樣品21與A組的其他樣品表現(xiàn)出較大的遺傳距離，獨立成為1個亞組。B組包括2個亞組，樣品3表現(xiàn)特殊，單獨成為1個亞組。

各供試樣品間的相似系數(shù)介于0.514～1.00，其中樣品18與26，樣品22與36的相似系數(shù)最大（1.00），樣品5與20，3與19及3與20的相似系數(shù)最?。?.514）（數(shù)據(jù)未列出）。

2.1.3 群體遺傳結構分析 將36個樣品的K值設為1～5，進行貝葉斯遺傳分析，運行5次重復后，發(fā)現(xiàn)最適K值為2（圖2）。

使用STRUCTURE軟件得到了與UPGMA聚類分析相似的結果，根據(jù)似然值的對數(shù)函數(shù)確定最佳類群數(shù)為K=2，當K>2時，同一K值不同運行重復間波動幅度非常大。

在K=2的情況下，將36份供試樣品分為2組，以綠色為主的20份供試樣品視為A組，以紅色為主的16份供試樣品視為B組。其中部分樣品表現(xiàn)為2個基因池的混合，樣品21、32、1、35、33以綠色為主體，構成A組中的1個亞組；樣品8、17和6以紅色為主體，構成B組的第1亞組，由于樣品27中紅綠的比例與其他的差別較大，可以認為是在B組中獨立成為第2亞組（圖3）。

對三葉海棠所有樣品進行的主成分分析，進一步證實了以上的結果，PCA結果（圖4）顯示，36個樣品被明顯分成2組，表明三葉海棠之間產(chǎn)生了一定的遺傳分化。在右側的一組中可以分成2個亞組，其中樣品21與其他樣品之間有一定的界限。左側的一組樣品中，樣品27也表現(xiàn)出與其他樣品之間存在一定的差異。

2.2 不同大小樣本量群體的遺傳多樣性分析

2.2.1 不同大小樣本量群體的遺傳多樣性參數(shù)比較

因供試的36株三葉海棠單株的聚類分析中，18與26及22與36的遺傳相似系數(shù)分別為1，所以在下面的研究中去掉了18及22號樣本，從剩余的34株單株中，隨機抽取6，9，12，15，18，27，34株組成具有不同樣本數(shù)量的7個群體進行遺傳多樣性的比較（表3）。隨著樣本量的增加，平均等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）呈上升的趨勢。通過比較可以看出Control（34）與Ⅰ（6）的差別最大，平均等位基因數(shù)（Na）分別為7.1和4.1，有效等位基因數(shù)（Ne）分別為4.02和3.035，香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）分別為1.472和1.169，表明樣本量的大小影響了群體的遺傳多樣性的分析結果。但是在樣本量大于15株以后，Ne與對照組Control（34）的差異不顯著。各群體的觀察雜合度（Ho）隨著樣本量增加有下降的趨勢，在樣本量大于15株以后Ho表現(xiàn)較小的差異，而期望雜合度（He）在Ⅳ（15）中表現(xiàn)出最大值（0.716）。綜合考慮各群體間的遺傳多樣性參數(shù)，只要保證樣本量不小于15株，樣本量的大小就不會對群體內(nèi)遺傳多樣性水平產(chǎn)生明顯的影響。

2.2.2 不同大小樣本量群體的遺傳一致度分析 從各群體的遺傳一致度的程度來看（表4），與Control（34）的遺傳一致度最大的是Ⅵ（27），遺傳一致度為0.995，最小的是Ⅰ（6），遺傳一致度為0.905。隨著樣本量的增加，遺傳一致度逐漸升高表明樣本量的大小對遺傳一致度有一定的影響。當樣本量大于15株以后，與Control（34）遺傳一致度的差異就不明顯了，所以樣本取樣量大于等于15株就足以代表整個群體的水平。

2.2.3 稀有等位基因在不同大小樣本量群體內(nèi)的變化分析 稀有等位基因是指群體內(nèi)其基因頻率低于5%的等位基因。群體內(nèi)的遺傳多樣性差異很大程度上是由于稀有等位基因結合或綜合到基因型背景中。因群體樣本量的不同，會造成稀有等位基因數(shù)目的增加或缺失，從而造成等位基因數(shù)目的變化。由表5可以看出，Ⅰ（6）和Ⅱ（9）的稀有等位基因數(shù)明顯的低于Control（34），與對照共有的等位基因數(shù)隨著樣本量的增加呈遞增的趨勢，而其丟失數(shù)呈遞減的趨勢。樣本量大于12株以后，稀有等位基因丟失數(shù)目的差異很小，樣本量大于18株以后，群體本身所有的稀有等位基因數(shù)目同與對照組Control（34）共有的稀有等位基因數(shù)目相等。表明樣本量的大小影響稀有等位基因的數(shù)目，樣本量的增加可以增加稀有等位基因的數(shù)目，從而可以影響等位基因的數(shù)目。

3 討 論

3.1 三葉海棠群體的遺傳多樣性及遺傳結構

本試驗結果表明，清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性較豐富（He=0.699，I=1.458，Ne=3.954），高于湖北海棠[25] [Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.、（He= 0.262 8， I=0.401 5， Ne=1.437 5）]、變?nèi)~海棠[5] [Malus toringoides（Rehd.）Hughes.（He=0.438 9，I=0.628 2，Ne =1.81）]。可能的原因之一是三葉海棠相比后兩者，無融合生殖能力較弱[26]，通過雜交進而獲得了較豐富的遺傳變異。與新疆野蘋果[27] [Malus sieversii（Ledeb.）Roem（He=0.261 9，I= 0.408 2，Ne=1.425 2）]、山荊子[6] [Malus baccata（Linn.）Borkh.（H=0.3386，I= 0.496 1，Ne=1.602 1）]等自交不親和的蘋果屬植物相比較，三葉海棠的遺傳多樣性也表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。在野外樣品調(diào)查采集的過程中我們發(fā)現(xiàn)，清涼峰地區(qū)由于設立自然保護區(qū)的緣故，三葉海棠的分布未受到明顯的人為破壞，經(jīng)過長時間的世代更迭積累了豐富的遺傳變異，因此表現(xiàn)出較高水平的遺傳多樣性。

STRUCTURE的分析結果表明，所選36份樣品中存在2個基因源，部分樣品表現(xiàn)為2個基因源的混合，其中樣品27表現(xiàn)的更為獨特。對三葉海棠UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)36份樣品明顯分為2組，在第1組中，樣品21與其他樣品相似系數(shù)較小，獨立成為1個亞組，在第2組中，樣品3獨立成為1個亞組。主成分分析（PCA）同樣將36份海棠樣品分成2組，樣品21、27均表現(xiàn)出與各自所在組群的樣品存在一定的差異。由于不同的分析方法所提供的信息量不同導致不同的分析方法產(chǎn)生的結果并不完全一致?；谇鍥龇宓貐^(qū)三葉海棠表現(xiàn)出遺傳結構的混合和2個基因源存在的事實，清涼峰地區(qū)的三葉海棠最適合進行就地保護，從而最大程度地保存清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平。

3.2 三葉海棠群體遺傳多樣性研究中的適宜樣本量

樣本量大小是影響種質(zhì)遺傳多樣性和群體內(nèi)遺傳結構分析的重要因素。三葉海棠作為異花授粉的植物，從理論上講如果群體的樣本量無限大，那么所有的遺傳特點全部呈現(xiàn)出來，但在實際的操作中，由于人力、物力和財力多方面因素的影響，不可能采集無限多的樣本量，而樣本量過小則無法呈現(xiàn)出研究對象的遺傳特性；群體內(nèi)的遺傳結構要得到完全的體現(xiàn)，稀有等位基因的分布與數(shù)目變化情況就要和整個群體的保持一致。所以找出一個適宜群體樣本量，使得所選擇的群體樣本量能代表原始群體的遺傳多樣性水平是至關重要的。徐重益等[28]在對菜薹種質(zhì)繁殖群體大小的研究發(fā)現(xiàn)： 大于30株的群體能代表200株整體群體的遺傳多樣性；班霆等[29]在對苜蓿遺傳多樣性的取樣數(shù)目的研究中表明： 采用40個單株的DNA混合樣是較適宜的群體大小。本研究通過隨機抽樣得到不同大小樣本量的7個群體，通過比較各群體的遺傳多樣性參數(shù)、遺傳一致度及不同大小樣本量群體內(nèi)稀有等位基因數(shù)的變化情況，表明只要保證樣本量≥15株，樣本量的大小就不會對群體內(nèi)遺傳多樣性水平、遺傳一致度及群體內(nèi)等位基因數(shù)目產(chǎn)生明顯的影響。這與楊軍等[30]在對杜梨實生繁殖群體的研究認為杜梨種質(zhì)保存、更新的適宜群體量為15株以上的研究結果相似。因此，在三葉海棠種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究中至少采集15株的樣本量，就可以代表原始群體的遺傳多樣性水平。在遷地保護時，也應該至少有15株的保存量才能保證其群體遺傳多樣性的完整保存。

綜上所述，浙江省臨安市與安徽省交界的清涼峰地區(qū)的三葉海棠具有較高的遺傳多樣性水平，群體內(nèi)也存在一定程度的遺傳分化。本研究也為三葉海棠遺傳多樣性的保存提供了理論基礎，同時為我國整個三葉海棠的遺傳多樣性的評價研究提供了借鑒。

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