冉春　張?jiān)骑w　陳飛　劉浩強(qiáng)　李鴻筠　胡軍華　姚廷山

摘 要： 【目的】為了明確谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，過(guò)氧化氫酶（CAT）基因在柑橘全爪螨Panonychus citri抗性中的作用，【方法】在室內(nèi)用噻螨酮對(duì)柑橘全爪螨進(jìn)行抗性選育，進(jìn)一步構(gòu)建抗/敏品系數(shù)字基因表達(dá)譜，采用RPKM法對(duì)柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗性品系3種代謝抗性相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)差異分析。【結(jié)果】經(jīng)過(guò)20代抗性選育，獲得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，與敏感品系比較，柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮的抗性倍數(shù)達(dá)到3 532.12倍?；虿町愋苑治霭l(fā)現(xiàn)，抗性品系中有11條GST基因、17條CarE基因和6條 CAT基因表達(dá)上調(diào)；14條GST基因、24條CarE基因和3條 CAT基因表達(dá)下調(diào)。上調(diào)倍數(shù)最高的GST基因、CarE基因和CAT基因分別為Unigene31530 [log2 ratio（RS/SS）=1.05]、Unigene23121 [log2 ratio（RS/SS）=2.05]和Unigene31477 [log2 ratio（RS/SS）=10.04]。進(jìn)一步對(duì)Unigene31477進(jìn)行熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，抗性和敏感品系基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異?！窘Y(jié)論】根據(jù)柑橘全爪螨抗/敏性品系基因表達(dá)差異推斷，GST、CarE和CAT基因可能與柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮產(chǎn)生的抗性沒(méi)有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 柑橘全爪螨； 噻螨酮； 抗性品系； 敏感品系； 代謝酶； 基因表達(dá)差異

中圖分類號(hào)：S666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0022-06

柑橘全爪螨Panonychus citri （McGregor）又名柑橘紅蜘蛛，屬蜘蛛綱蜱螨目葉螨科，是一種世界廣泛分布的重要害螨。柑橘全爪螨主要吸食柑橘葉片、嫩梢、花蕾和果實(shí)汁液，嚴(yán)重時(shí)引起落葉、落花、落果，造成減產(chǎn)。化學(xué)防治仍是控制柑橘全爪螨最有效的措施，但由于其個(gè)體小、世代多、繁殖力強(qiáng)，對(duì)藥劑極易產(chǎn)生抗性。目前，柑橘全爪螨已對(duì)大多數(shù)登記的有機(jī)磷、菊酯類殺螨劑產(chǎn)生了抗性[1-4]，專用殺螨劑抗性也極其突出[5-6]。噻螨酮屬噻唑烷酮類低毒選擇性專用殺螨劑，對(duì)柑橘全爪螨卵、幼螨、若螨活性極強(qiáng)，是低溫下防治柑橘全爪螨的理想產(chǎn)品，在許多柑橘主產(chǎn)國(guó)廣泛應(yīng)用[7-8]。由于施用不當(dāng)，柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮已產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性[9]，因而有必要建立其科學(xué)的抗性治理策略。弄清抗性機(jī)理是進(jìn)行抗性治理的基礎(chǔ)。

水解酶和保護(hù)酶活性增強(qiáng)是昆蟲(chóng)（螨類）對(duì)殺蟲(chóng)（螨）劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制[10-11]，而基因的上調(diào)是3種代謝酶活性增強(qiáng)最直接的原因，因此，弄清代謝抗性相關(guān)基因表達(dá)差異是深入研究昆蟲(chóng)（螨類）抗性分子機(jī)理的重要途徑。鑒于此，筆者通過(guò)室內(nèi)選育，獲得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，進(jìn)一步探討了抗性和敏感品系之間谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，過(guò)氧化氫酶（CAT）基因的表達(dá)差異，旨在弄清柑柑橘全爪螨抗性與3種代謝抗性相關(guān)基因表達(dá)差異的關(guān)系，從而明確柑橘全爪螨抗性產(chǎn)生可能的分子機(jī)理，為抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蟲(chóng)源：柑橘全爪螨于2005年采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所多年未施用藥劑的檸檬上，后經(jīng)室內(nèi)不接觸藥劑連續(xù)飼養(yǎng)至今，視為相對(duì)敏感品系。柑橘全爪螨飼養(yǎng)溫度為（25±1） ℃、相對(duì)濕度為70% ～80%，光周期L∶D =14 h∶10 h。

供試藥劑：50 g·L-1噻螨酮（hexythiazox）乳油，日本曹達(dá)株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.2 柑橘全爪螨的生物測(cè)定

采用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的玻片浸漬法[12]。在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在柑橘全爪螨雌成螨死亡率20%～90%內(nèi)按等比級(jí)數(shù)將供試藥劑分別配成5～7個(gè)濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。處理時(shí)將雙面膠帶剪成3 cm長(zhǎng)貼在載玻片的一端，用細(xì)毛筆挑起健康雌成螨，背部貼在膠帶上，每塊載玻片60頭，每處理重復(fù)5次，共300頭。將載玻片分別浸入藥液，輕輕搖動(dòng)5 s后取出，用吸水紙吸凈螨體多余的藥液，在室溫下晾干，15 min后放入光照培養(yǎng)箱（溫度（25±1） ℃，相對(duì)濕度為70%～80%，光周期L∶D =14∶10），24 h后在雙筒解剖鏡下分別觀察死、活螨數(shù)，以清水處理為對(duì)照。

1.3 柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系選育

柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系從敏感品系選育而來(lái)。測(cè)定敏感品系（F0）對(duì)噻螨酮的敏感基線，然后以殺死品系70%～90%的噻螨酮濃度處理成螨，記錄存活數(shù)量，存活個(gè)體繼續(xù)飼養(yǎng)和藥劑汰選，選擇壓力相近，每隔2代測(cè)定1次LC50（方法同1.2），觀察抗性增長(zhǎng)速度。

1.4 柑橘全爪螨代謝抗性相關(guān)基因差異性分析

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的基因信息從本課題組柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得[13]?；虮磉_(dá)譜文庫(kù)構(gòu)建參照Wang等[14]的方法 ，采用TRIzol試劑盒分別提取柑橘全爪螨噻螨酮抗/敏品系約10 μg總RNA，經(jīng)質(zhì)量分析合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation buffer使其成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，分別合成cDNA第1鏈和第2鏈，經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A和測(cè)序接頭，回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成整個(gè)文庫(kù)制備工作，構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，去除雜質(zhì)后得到clean reads，使用短reads比對(duì)軟件SOAPaligner/soap[15]將clean reads分別比對(duì)到參考基因組和參考基因序列，利用唯一比對(duì)上基因的reads數(shù)目和比對(duì)上參考序列的總reads數(shù)來(lái)計(jì)算基因表達(dá)量（reads per kb per million reads， RPKM）[16]，其公式為：

設(shè)RPKM（A）為基因A的表達(dá)量，則C為唯一比對(duì)到基因A的reads數(shù)，N為唯一比對(duì)到參考基因的總reads數(shù)，L為基因A的堿基數(shù)。RPKM法能消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異。

1.5 柑橘全爪螨不同品系CAT基因定量分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法測(cè)定柑橘全爪螨抗性和敏感品系CAT 基因的相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，前引物為：GTACCTTTTCCGTTGATGGTTC，后引物為：GTGGCCTTTGAAACACTTTCC，以ELF1A[17]為內(nèi)參基因，在Bio-Rad icycler iQ分析系統(tǒng)上進(jìn)行操作，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后收集Ct 值，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△C法[18]進(jìn)行計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用Abbott公式計(jì)算校正死亡率。所得數(shù)據(jù)用SAS（6.12）統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算毒力回歸方程，致死中濃度LC50及其95%置信度以及相關(guān)系數(shù)等參數(shù)，采用卡方（χ2）檢驗(yàn)毒力回歸方程真實(shí)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮的抗性選育

柑橘全爪螨抗性選育結(jié)果見(jiàn)圖1。以70%～90%的死亡率作為選擇壓力，經(jīng)過(guò)20代抗性選育，LC50由選育前的0.05 mg·L-1上升到197.79 mg·L-1，抗性倍數(shù)達(dá)3 532.12，柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮抗性發(fā)展總體上非常迅速。前4代、第7代至第12代、第19代至第20代抗性發(fā)展相對(duì)較慢，而抗性發(fā)展較迅速的主要有2個(gè)階段，第1階段為第5代至第6代，第2階段為第13代至第18代。第20代后的抗性發(fā)展?fàn)顩r還需進(jìn)一步觀察和研究。

2.2 柑橘全爪螨GST基因表達(dá)差異分析

通過(guò)BLAST搜索比對(duì)，從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組中鑒定出25條相似度較高的GST基因（E-value， le-5，下同）（表1），通過(guò)進(jìn)一步差異性分析發(fā)現(xiàn)，抗性品系中有11條GST基因表達(dá)上調(diào)，14條GST基因表達(dá)下調(diào)，其中Unigene31530上調(diào)倍數(shù)最高[log2 ratio （RS/SS）為1.05]，Unigene18331下調(diào)倍數(shù)最高[log2 ratio（RS/SS）為-10.37]，其他GST基因上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)介于[-2

2.3 柑橘全爪螨羧酸酯酶基因表達(dá)差異分析

對(duì)鑒定出的39條相似度較高的CarE基因進(jìn)行差異性分析（表2），抗性品系中有17條CarE基因表達(dá)上調(diào)，22條CarE基因表達(dá)下調(diào)，下調(diào)基因數(shù)多于上調(diào)基因數(shù)，其中Unigene23121上調(diào)倍數(shù)最高[log2 ratio （RS/SS）為2.05]，Unigene30172下調(diào)倍數(shù)最高[log2 ratio（RS/SS）為-11.52]，其次為Unigene9042[log2 ratio（RS/SS）為-9.72]，其他CarE基因上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)相對(duì)較低[-3

2.4 柑橘全爪螨過(guò)CAT基因表達(dá)差異分析

對(duì)鑒定出的9條相似度較高的CAT基因進(jìn)行差異性分析（表3），抗性品系中有6條表達(dá)上調(diào)，3條表達(dá)下調(diào)，上調(diào)基因數(shù)明顯多于下調(diào)基因數(shù)，其中U（nigene31477上調(diào)倍數(shù)最高[log2 ratio （RS/SS）達(dá)到了10.04]，Unigene9876下調(diào)倍數(shù)最高[log2 ratio（RS/SS）為-0.56]，其他過(guò)氧化氫酶基因上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)介于[-0.38≤log2 Ratio（RS/SS） ≤1.05]。進(jìn)一步對(duì)Unigene31477進(jìn)行熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，抗性品系和敏感品系基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（圖2）。

3 討 論

噻螨酮由于對(duì)葉螨卵和若螨具有特殊防效而被廣泛用于柑橘全爪螨的防治，但由于長(zhǎng)期單一使用，柑橘全爪螨極易對(duì)其產(chǎn)生抗性。在日本，連續(xù)使用6年的果園，LC50 由25 mg·L-1上升至 9 000 mg·L-1；研究者在田間進(jìn)一步通過(guò)對(duì)相對(duì)敏感品系施用噻螨酮連續(xù)17 次篩選，再經(jīng)室內(nèi)連續(xù)6 代篩選后，柑橘全爪螨抗性倍數(shù)高達(dá)到23 000倍[19-20]。本研究使用噻螨酮對(duì)橘全爪螨進(jìn)行20代抗性選育，LC50由選育前的0.05 mg·L-1上升到197.79 mg·L-1，抗性倍數(shù)達(dá)3532.12，抗性發(fā)展極其迅速，達(dá)到了極高水平抗性。鑒于此，柑橘全爪螨防治過(guò)程中必須高度重視其抗藥性，生產(chǎn)上可選用其他作用機(jī)制不同的殺螨劑與之輪用，以控制噻螨酮年使用次數(shù)。

已有的生化機(jī)理研究表明，柑橘全爪螨對(duì)專用殺螨的抗性可能與GST和CarE活性增強(qiáng)有關(guān)。陳達(dá)榮等[1]報(bào)道了柑橘全爪螨體內(nèi)CarE的活性與有機(jī)磷類藥劑的抗性呈正相關(guān)。陳年春等[2]研究發(fā)現(xiàn)GST解毒活性的增強(qiáng)可能是柑橘全爪螨對(duì)水胺硫磷產(chǎn)生抗性的主導(dǎo)機(jī)制，CarE代謝能力的增強(qiáng)可能是柑橘全爪螨對(duì)甲氰菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因。孟和生等[21]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘全爪螨體內(nèi)GST活性的提高是其對(duì)噠螨靈產(chǎn)生抗性的重要原因。Ran等[22]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮的抗性與體內(nèi)CarE的活力增加有關(guān)。Niu等[23]報(bào)道GST活性與柑橘全爪螨不同田間種群藥劑敏感性有一定關(guān)系。本研究通過(guò)分析柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗藥品系GST和CarE基因表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，抗藥品系中有11條GST基因和17條CarE基因表達(dá)上調(diào)，但GST基因和CarE基因上調(diào)倍數(shù)均不太高，可能與柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮的抗性關(guān)系不太密切。

CAT、SOD和POD在昆蟲(chóng)體內(nèi)的主要功能是通過(guò)協(xié)調(diào)作用清除自由基，防御活性氧或其它過(guò)氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害。目前已有資料報(bào)道保護(hù)酶系統(tǒng)活性增強(qiáng)可能與赤擬谷盜和剌蛾等昆蟲(chóng)的抗藥性有關(guān)[11，24]。本研究對(duì)柑橘全爪螨數(shù)字基因表達(dá)譜比較分析發(fā)現(xiàn)，噻螨酮抗性品系中CAT基因（Unigene31477）上調(diào)倍數(shù)極高，但進(jìn)一步定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，抗性和敏感品系Unigene31477表達(dá)水平并不存在顯著差異，2種分析方法出現(xiàn)的結(jié)果差異主要是由于高通量測(cè)序過(guò)程中較高的RDR引起。根據(jù)Unigene31477定量分析結(jié)果推斷，CAT基因與柑橘全爪螨對(duì)噻螨酮的抗性同樣關(guān)系不太密切。