劉鍇棟　袁長(zhǎng)春　黎海利　陳春華　譚雪瓊

摘 要： 【目的】為指導(dǎo)楊桃種質(zhì)資源的引進(jìn)以及良種選育提供科學(xué)依據(jù)，【方法】采用形態(tài)標(biāo)記數(shù)量聚類(lèi)分析和RAPD分子標(biāo)記相結(jié)合，對(duì)廣東地區(qū)10份楊桃品種資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并將形態(tài)學(xué)聚類(lèi)和RAPD分子標(biāo)記聚類(lèi)結(jié)果加以對(duì)比?！窘Y(jié)果】在所觀察的12個(gè)形態(tài)性狀中，變異系數(shù)為14.08%～49.71%，平均變異系數(shù)為25.38%。從100條RAPD隨機(jī)引物中篩選出10個(gè)引物，共擴(kuò)增出58條帶，其中53條為多態(tài)性帶，多態(tài)率達(dá)93.02%。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，形態(tài)標(biāo)記和RAPD標(biāo)記都可依果實(shí)風(fēng)味將供試材料分組，即甜味和酸味。2種標(biāo)記方法的相關(guān)系數(shù)為r0.01=0.685 3，達(dá)到顯著水平?！窘Y(jié)論】楊桃具有豐富的遺傳多樣性，2種方法聚類(lèi)結(jié)果相似，且相關(guān)性高，具有較高的可靠性。

關(guān)鍵詞： 楊桃； 形態(tài)性狀； RAPD； 聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0069-06

楊桃（Averrhoa carambola L.）又名五斂子、陽(yáng)桃、洋桃等，屬酢漿草科（Oxalidaceae）楊桃屬（Averrhoa Linn.）植物。因其橫切面如五角星，故國(guó)外又稱(chēng)之為“星梨”[1]。最早從馬來(lái)西亞及越南傳入我國(guó)，已有2000多年栽培歷史，是久負(fù)盛名的嶺南佳果之一。楊桃果形美，味甜，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。既可鮮食，也可加工成多種加工品。葉、果、花、根都可入藥。此外，楊桃生長(zhǎng)快，早結(jié)豐產(chǎn)，可周年供果，耐旱、耐瘠，適應(yīng)性強(qiáng)，病蟲(chóng)害少，經(jīng)濟(jì)效益好，是著名的嶺南佳果之一[2-3]。

廣東省作為楊桃的主要產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)從臺(tái)灣、新加坡、馬來(lái)西亞、泰國(guó)等地引進(jìn)許多新的品種，并通過(guò)嫁接方式培育了不少經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的品種。隨著引進(jìn)品種的不斷增多，而當(dāng)?shù)赜钟胁簧俚胤狡贩N，這就造成楊桃品種繁雜和混亂，且出現(xiàn)了不少同名異種或同種異名現(xiàn)象，給果農(nóng)選種育苗帶來(lái)較大的困難，也對(duì)產(chǎn)量造成很大的影響。

目前對(duì)于楊桃種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究報(bào)道較少，劉韜等[4]對(duì)福建省主要楊桃品種遺傳多樣性進(jìn)行了RAPD分子標(biāo)記分析，將17份楊桃品種劃分為3 個(gè)類(lèi)群，并得出楊桃品種資源之間具有豐富的多態(tài)性，證明了RAPD標(biāo)記在楊桃遺傳多樣性研究中的可行性。傳統(tǒng)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究方法除了分子標(biāo)記還有根據(jù)形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行研究的方法。而分子標(biāo)記與形態(tài)性狀的聚類(lèi)分析結(jié)果各有側(cè)重，相互補(bǔ)充[5]。在研究中把分子生物學(xué)手段與形態(tài)性狀比較鑒定結(jié)合起來(lái)分析可以避免單一方法對(duì)研究結(jié)果造成偏差[6-7]，而且結(jié)合形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)研究植物種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系已被證實(shí)是可行和可靠的[8-9]，但應(yīng)用這2種技術(shù)對(duì)楊桃進(jìn)行遺傳多樣性研究至今未有報(bào)道。

因此，筆者利用RAPD技術(shù)和形態(tài)標(biāo)記數(shù)量聚類(lèi)分析方法對(duì)廣東地區(qū)10個(gè)主要楊桃品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對(duì)其進(jìn)行綜合客觀評(píng)價(jià)，以期為楊桃種質(zhì)的鑒定、保存、創(chuàng)新以及嫁接栽培選擇合適的砧木提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)廣東楊桃品種的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，為當(dāng)?shù)貤钐屹Y源保護(hù)、種質(zhì)資源的引進(jìn)、新品種選育以及核心種質(zhì)構(gòu)建提供參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

材料分別采集于廣東地區(qū)湛江、茂名、陽(yáng)江等地種植的臺(tái)灣、泰國(guó)、馬來(lái)西亞和新加坡等7個(gè)引進(jìn)品種和粵西地區(qū)3個(gè)本地品種的葉片，具體見(jiàn)表1。

1.2 植物學(xué)特征的統(tǒng)計(jì)與編碼賦值

楊桃果樹(shù)葉性狀在果樹(shù)達(dá)到生長(zhǎng)盛期時(shí)調(diào)查，在種植地隨機(jī)選取5株有代表性的植株，每株隨機(jī)選取10枚葉片觀察，數(shù)量性狀的記錄數(shù)值為5株的平均值；果實(shí)性狀的調(diào)查在達(dá)到商品成熟度時(shí)進(jìn)行；在種植地隨機(jī)選取生長(zhǎng)正常的楊桃5個(gè)，數(shù)量性狀的記錄數(shù)值為5個(gè)果實(shí)的平均值。通過(guò)對(duì)各楊桃品種葉片和果實(shí)的形態(tài)觀察，分別選取12個(gè)性狀進(jìn)行數(shù)量分類(lèi)研究，并進(jìn)行編碼賦值。調(diào)查的具體性狀和編碼情況見(jiàn)表2。參照郭先鋒等[10]的數(shù)量分類(lèi)學(xué)方法對(duì)不同品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，并繪制樹(shù)狀圖。

1.3 DNA提取方法及檢測(cè)

楊桃總DNA的提取采用改良的2×CTAB法[11]，用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm下測(cè)定OD值，檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，并稀釋到30 mg·L-1。

1.4 RAPD標(biāo)記

從100條隨機(jī)引物中篩選出10條條帶清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)的引物，并用這10條引物對(duì)10份楊桃樣品的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

RAPD-PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包括： 10×PCR buffer 2.5 μL，20 mmol·L-1 MgCl2 2.5 μL，2 mol·L-1 dNTP 2.5 μL，8 pmol·L-1隨機(jī)引物1 μL，2 U Taq酶，30 ng模板DNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中，用1.5%瓊脂糖凝膠（含GoldView I 型核酸染色劑）中以5 V·cm-1的電壓電泳分離。用BioRad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算

1.5.1 形態(tài)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算 形態(tài)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)計(jì)算為性狀標(biāo)準(zhǔn)差/性狀平均值；聚類(lèi)分析使用“DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)”中的“多元分析—聚類(lèi)分析”軟件包完成，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化使用“標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化”命令，相似性系數(shù)的計(jì)算使用“歐式距離系數(shù)”，聚類(lèi)方法采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）[12]。

1.5.2 RAPD 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算 將電泳圖譜清晰且可重復(fù)的條帶賦值為1，同一位置上的弱帶且不重復(fù)或未出現(xiàn)帶的賦值為0，形成1、0數(shù)據(jù)矩陣，計(jì)算單位引物擴(kuò)增的條帶、多態(tài)性條帶及多態(tài)性條帶百分率[13]。根據(jù)Nei-Li相似系數(shù)法[14]，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算出遺傳距離。以遺傳距離為標(biāo)準(zhǔn)，用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析，生成聚類(lèi)圖。

1.5.3 形態(tài)數(shù)據(jù)與RAPD數(shù)據(jù)的比較 利用“DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)”，得到由形態(tài)學(xué)指標(biāo)計(jì)算生成的歐氏距離矩陣和由電泳條帶賦值計(jì)算生成的RAPD遺傳距離矩陣。然后用Mantel test[15]對(duì)由形態(tài)學(xué)指標(biāo)計(jì)算所得的歐氏距離矩陣和RAPD遺傳距離矩陣之間的相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)。具體使用TFPGA軟件中的Mantel test模塊檢測(cè)。2個(gè)矩陣輸入TFPGA軟件包[16]，利用其中的Mantel test模塊檢測(cè)2者相關(guān)性，顯著性檢驗(yàn)共進(jìn)行10 000次隨機(jī)運(yùn)算[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊桃供試材料的植物學(xué)形態(tài)數(shù)量性狀分析

對(duì)10個(gè)楊桃品種的7個(gè)植物學(xué)形態(tài)數(shù)量性狀的基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，7個(gè)數(shù)量性狀的平均變異系數(shù)為25.38%，其中以單果質(zhì)量性狀變化最大，變異系數(shù)為49.71%。單果質(zhì)量最大的是‘秤錘，平均單果質(zhì)量為402.43 g；單果質(zhì)量最小的是細(xì)花，平均單果質(zhì)量為81.73 g。葉長(zhǎng)寬比性狀差異也較大，最大的是‘細(xì)花，為3.12，最小的是‘臺(tái)農(nóng)一號(hào)，為1.5。因此，可以從果實(shí)質(zhì)量和葉片長(zhǎng)寬比來(lái)區(qū)分各種質(zhì)。變異系數(shù)最小的是葉面積，為14.08%，也超過(guò)了10%。以上結(jié)果說(shuō)明各性狀在不同種質(zhì)材料之間存在著較大差異以及不同程度的多樣性。

2.2 楊桃供試材料植物學(xué)形態(tài)性狀聚類(lèi)分析

對(duì)10個(gè)楊桃品種的12個(gè)植物學(xué)形態(tài)性狀（包括質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀）的基本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖1。當(dāng)λ=5.31時(shí)，10個(gè)楊桃品種分為兩大類(lèi)，本地酸楊桃品種‘細(xì)花、‘新橋和‘麻章二號(hào)聚為一類(lèi)，其余外來(lái)引進(jìn)品種聚為一類(lèi)。當(dāng)λ=3.18時(shí)，可將供試品種分為5類(lèi)，‘臺(tái)灣紅楊桃和‘秤錘2個(gè)品種聚為一類(lèi)，這2個(gè)品種均來(lái)自臺(tái)灣，都表現(xiàn)出單果質(zhì)量量大、汁多味甜、葉卵形和葉長(zhǎng)較短等特點(diǎn)；‘泰國(guó)楊桃和‘馬來(lái)西亞B17歸為一類(lèi)，2個(gè)品種均表現(xiàn)出葉長(zhǎng)和葉寬較大、果實(shí)較長(zhǎng)和單果質(zhì)量量較大等特點(diǎn)；‘蜜絲、‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)和‘新加坡楊桃為一類(lèi)；‘細(xì)花單獨(dú)為一類(lèi)；‘新橋和‘麻章二號(hào)聚為一類(lèi)。‘新橋和‘麻章二號(hào)這2個(gè)粵西本地品種均表現(xiàn)出果實(shí)味道較酸、葉較長(zhǎng)、單果質(zhì)量量較小等特點(diǎn)。由以上結(jié)果可以看出，基于楊桃形態(tài)性狀的聚類(lèi)結(jié)果能較好地反映種質(zhì)間的親緣關(guān)系和形態(tài)相似性。

2.3 RAPD引物篩選及多態(tài)性分析

通過(guò)對(duì)10份楊桃種質(zhì)資源的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出58條可區(qū)分的、重復(fù)性高的DNA條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，共有檢出位點(diǎn)58個(gè)，不同的隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果各不相同，其中單態(tài)位點(diǎn)5個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)53個(gè)，多態(tài)率達(dá)93.02%。G9引物的擴(kuò)增位點(diǎn)最多，為9個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)。平均每個(gè)引物擴(kuò)增出條帶5.8條。這說(shuō)明RAPD擴(kuò)增出來(lái)的楊桃DNA片段多態(tài)性比較豐富，同時(shí)也表明這10份楊桃樣品在分子水平上存在明顯的差異。

2.4 楊桃供試材料RAPD分子標(biāo)記聚類(lèi)分析

基于遺傳距離進(jìn)行聚類(lèi)分析所得的樹(shù)狀圖見(jiàn)圖2。10份楊桃遺傳距離為0.16129～0.53146。當(dāng)λ=0.48時(shí)，10份楊桃可以劃分為3個(gè)類(lèi)群：第I類(lèi)群包括‘臺(tái)灣紅楊桃、‘秤錘、‘馬來(lái)西亞B17、‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)、‘蜜絲、‘新加坡楊桃、‘泰國(guó)楊桃；第II類(lèi)群包含‘新橋和‘麻章二號(hào)2個(gè)本地品種；第III類(lèi)群包括‘細(xì)花。根據(jù)楊桃風(fēng)味可以劃分為甜楊桃和酸楊桃兩大類(lèi)，聚類(lèi)分析結(jié)果表明，第I類(lèi)群的楊桃品種基本都屬于甜楊桃品種，且都是外來(lái)引進(jìn)品種，來(lái)自臺(tái)灣的‘臺(tái)灣紅楊桃、‘秤錘、‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)和‘蜜絲這4個(gè)品種聚為一起，遺傳距離較近；第II、III類(lèi)群中的楊桃品種都是廣東粵西地區(qū)的酸楊桃品種。

2.5 楊桃供試材料RAPD標(biāo)記與形態(tài)學(xué)之間的相關(guān)分析

利用TFPGA軟件中的Mantel test模塊檢測(cè)對(duì)由基于形態(tài)標(biāo)記計(jì)算的遺傳距離矩陣和由RAPD標(biāo)記計(jì)算的遺傳距離矩陣作相關(guān)分析，分析2個(gè)距離矩陣數(shù)值（圖3），得出兩個(gè)矩陣的相關(guān)系數(shù)為r0.01=0.685 3，達(dá)到顯著水平，表明RAPD分子標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記所反映的品種間的遺傳多樣性有較高的一致性和可信度。因此將兩標(biāo)記結(jié)合起來(lái)可以較好地揭示楊桃種質(zhì)的遺傳多樣性。

3 討 論

3.1 廣東地區(qū)主要楊桃品種具有豐富的遺傳多樣性

近年來(lái)，廣東省大力發(fā)展楊桃生產(chǎn)，從臺(tái)灣、泰國(guó)、馬來(lái)西亞和新加坡等地引進(jìn)了不少優(yōu)良品種，使得廣東楊桃種質(zhì)資源類(lèi)型不斷豐富。但是由于頻繁引種，也使得廣東地區(qū)楊桃種質(zhì)資源較為混亂，因此分析它們之間的遺傳差異有助于指導(dǎo)種質(zhì)資源的引進(jìn)和品種遺傳改良，提高品質(zhì)和產(chǎn)量。

植物性狀遺傳多樣性的數(shù)量化表現(xiàn)主要集中在性狀的變異頻率，其中變異系數(shù)越大，就說(shuō)明樣本間的差異越大，可以在優(yōu)異種質(zhì)資源中有更大的選擇余地[17-18]。一般認(rèn)為變異系數(shù)大于10%就說(shuō)明樣本間的差異較大。本文對(duì)10個(gè)楊桃品種的形態(tài)性狀分析結(jié)果表明，各性狀之間的變異系數(shù)為14.08%～49.71%，平均變異系數(shù)為25.23%，葉長(zhǎng)7.03～10.71 cm，葉寬3.12～5.34 cm，葉面積23.69～38.23 cm2，葉長(zhǎng)寬比1.34～3.12，果長(zhǎng)7.50～12.20 cm，單果質(zhì)量81.73～402.43 g，整株果質(zhì)量45.23～129.76 kg。各個(gè)性狀的變異系數(shù)均高于10%，說(shuō)明各材料之間存在較大差異。RAPD擴(kuò)增條帶中，多態(tài)性達(dá)到93.02%，可見(jiàn)楊桃種質(zhì)資源在分子水平上存在遺傳差異。綜合分析，楊桃資源具有較為豐富的遺傳多樣性和遺傳背景的復(fù)雜性，存在較大的遺傳變異和選擇潛力，這與劉韜等[4]的研究結(jié)果較為一致。

從楊桃的RAPD分析結(jié)果可知，‘馬來(lái)西亞B17、‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)、‘秤錘都聚為一類(lèi)，特別是‘馬來(lái)西亞B17和‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)緊密聚在一起，這與劉韜等[4]的研究結(jié)果完全一致。但是有所不同的是，本研究中的‘泰國(guó)楊桃是和‘馬來(lái)西亞B17、‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)、‘秤錘等都聚為一類(lèi)的，而劉韜等[4]的研究結(jié)果顯示泰國(guó)種在聚類(lèi)分析處于不同的類(lèi)群，這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)研究中‘泰國(guó)楊桃可能存在同名不同種的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步分析探討。本研究RAPD聚類(lèi)分析中第I類(lèi)群的楊桃品種基本都屬于甜楊桃品種，且都是外來(lái)引進(jìn)品種，劉韜等[4]的RAPD聚類(lèi)分析研究結(jié)果也顯示第I類(lèi)群的楊桃品種全為外來(lái)引進(jìn)品種。這說(shuō)明，由分子標(biāo)記RAPD技術(shù)分析反映得出的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近和遺傳多樣性的情況可以得到重復(fù)性、可靠性的試驗(yàn)結(jié)果。RAPD技術(shù)只要材料選擇合適、反應(yīng)條件控制嚴(yán)格、分析數(shù)據(jù)詳實(shí)合理，就完全可以應(yīng)用在楊桃品種親緣關(guān)系分析過(guò)程中。

3.2 形態(tài)標(biāo)記和RAPD分子標(biāo)記結(jié)合分析具有一定的可靠性

在植物學(xué)性狀的比較分析中，形態(tài)學(xué)方法是最古老的物種鑒定方法，它具有直觀、標(biāo)記簡(jiǎn)便、容易獲得等特點(diǎn)，目前仍是植物遺傳多樣性研究的主要方法[19]。本研究基于形態(tài)標(biāo)記的聚類(lèi)分析結(jié)果將廣東地區(qū)楊桃主要品種劃分為兩大類(lèi)，各類(lèi)之間的形態(tài)差異較明顯。但由于表型是環(huán)境和基因型互作的結(jié)果，受環(huán)境影響較大，有些表型的變化并不是可遺傳的變異，因此單從形態(tài)學(xué)上研究遺傳多樣性具有一定的局限性[20]。部分研究結(jié)果也表明，形態(tài)性狀的差異不一定能反映遺傳上的差異，形態(tài)性狀的相似也不一定意味著遺傳關(guān)系的近緣[21]。近年來(lái)， 一些分子標(biāo)記方法逐步引入了植物的遺傳多樣性分析，劉韜等[4]對(duì)福建省主要楊桃品種遺傳多樣性進(jìn)行了RAPD分子標(biāo)記分析，將17份楊桃品種劃分為3個(gè)類(lèi)群，多態(tài)率達(dá)97.19%，證實(shí)了RAPD 技術(shù)可以準(zhǔn)確偵測(cè)到種間的遺傳多態(tài)性。因此，有必要結(jié)合形態(tài)學(xué)和RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)楊桃品種遺傳多樣性進(jìn)行更系統(tǒng)、更全面的分析。

本研究認(rèn)為，無(wú)論是形態(tài)學(xué)標(biāo)記還是RAPD分子標(biāo)記的結(jié)果都可以把楊桃分為甜楊桃和酸楊桃，這與傳統(tǒng)的分類(lèi)方法基本相符。這說(shuō)明利用2種標(biāo)記對(duì)楊桃種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分和鑒定都是行之有效的。利用Mantel test[15]對(duì)由形態(tài)學(xué)指標(biāo)計(jì)算所得的歐氏距離矩陣和RAPD遺傳距離矩陣之間的相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)，得出由2種技術(shù)得出矩陣的相關(guān)系數(shù)為0.685 3（P<0.01），達(dá)到顯著水平，這說(shuō)明形態(tài)標(biāo)記和RAPD標(biāo)記匹配良好。且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明形態(tài)標(biāo)記對(duì)楊桃種質(zhì)分類(lèi)有一定的可信度，RAPD分子標(biāo)記可將種質(zhì)間的遺傳差異進(jìn)一步表現(xiàn)出來(lái)。同時(shí)2種方法都基本可將楊桃品種按照種質(zhì)來(lái)源明顯的區(qū)分開(kāi)來(lái)。3個(gè)來(lái)自廣東粵西地區(qū)的本地品種都聚為一類(lèi)，來(lái)自臺(tái)灣地區(qū)的‘臺(tái)灣紅楊桃、‘秤錘、‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)和‘蜜絲4個(gè)品種在RAPD標(biāo)記聚類(lèi)分析中能聚在一起。因此，在楊桃遺傳多樣性研究和育種實(shí)踐中，可以以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)，與形態(tài)性狀充分結(jié)合，展開(kāi)分析，提高選種、育種工作的實(shí)際效率。

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