解淑慧　邵興鋒　王可　張興龍　王鴻飛

摘 要：【目的】為了確定浙江寧海本地柑橘優(yōu)勢腐敗菌及丁香精油對其的抑菌效果，【方法】從自然腐爛的柑橘上分離優(yōu)勢菌，采用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定方法結(jié)合rDNA-ITS序列分析方法進(jìn)行鑒定，并采用體外試驗(yàn)研究丁香精油對優(yōu)勢菌的抑菌效果。【結(jié)果】結(jié)果表明，浙江寧海本地柑橘分離所得6株真菌分別為指狀青霉（Penicillium digitatum）、柑橘鏈格孢（Alternaria citri）、枝孢樣枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）、 聚多曲霉〔Aspergillus sydowii）、近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）和卡利比克畢赤酵母（Pichia caribbica）；其中P. digitatum和C. cladosporioides是優(yōu)勢腐敗菌；體外抑菌試驗(yàn)表明，丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides有較好的抑菌效果，抑制中濃度（EC50）分別為2.51 mL·L-1和0.57 mL·L-1；最小抑菌濃度（MIC）分別為6 mL·L-1和3 mL·L-1?！窘Y(jié)論】丁香精油可以抑制柑橘采后主要病原菌的生長。

關(guān)鍵詞： 柑橘； 優(yōu)勢菌； 分離鑒定； rDNA-ITS； 丁香精油

中圖分類號：S666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0134-06

浙江是全國柑橘的主要產(chǎn)地之一，但是在柑橘采后貯藏過程中，真菌引起的病害造成約10%的損失或者更高，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為，指狀青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）是引起柑橘采后腐爛的主要真菌[1]。對柑橘等果實(shí)采后主要致病菌的分離鑒定，是選擇采后防腐保鮮方法的前提。

目前對真菌的鑒定主要采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，該方法由于經(jīng)驗(yàn)、時(shí)間等限制，在實(shí)踐中有一定的困難。近年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子手段被廣泛地應(yīng)用于真菌的分類鑒定，特別是rDNA- ITS 分子標(biāo)記法。真菌rDNA的引物ITS1和ITS4適用于大多數(shù)擔(dān)子菌和子囊菌的檢測。而由于真菌核酸序列的rDNA在18s、28s區(qū)域具有保守性，在ITS區(qū)段又存在在屬、種水平上的差異[2]。因此通過對ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測序，來檢測病原真菌的技術(shù)已越來越被廣泛應(yīng)用[3]。

丁香為桃金娘科植物丁香（Eugenia Cargophyllata Thunb） 的干燥花蕾，是我國的傳統(tǒng)中藥。丁香精油含有丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯等成分，對葡萄灰霉菌、鏈格孢、桔青霉等多種病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用[4-7]。有研究表明丁香精油對蘋果的采后貯藏有明顯的保鮮效果[8]， 但丁香精油在柑橘防腐保鮮上的研究鮮見報(bào)道。

我們擬從浙江寧海本地產(chǎn)柑橘上分離優(yōu)勢菌，采用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)分類鑒定結(jié)合rDNA- ITS 分子標(biāo)記法對所分離到的菌株進(jìn)行鑒定，以確定地產(chǎn)柑橘的優(yōu)勢腐敗菌；同時(shí)，進(jìn)一步分析丁香精油對柑橘主要優(yōu)勢腐敗菌的抑制效果，以期望將丁香精油這一綠色防腐保鮮方法應(yīng)用于柑橘采后病害的防治。

1 材料和方法

1.1 材料

柑橘品種為早熟宮川，選擇浙江寧海柑橘果園樹上自然發(fā)病和采后貯藏過程中自然腐爛的果實(shí)。丁香精油純度95%以上，購自成都科帝亞試劑有限公司。

1.2 柑橘采后優(yōu)勢菌的分離

從自然發(fā)病的柑橘果實(shí)病健處切取果皮組織，用75%的醫(yī)用酒精消毒1 min，無菌水沖洗下孢子接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），25 ℃培養(yǎng)[9]。經(jīng)多次劃線分離得純種菌株。

1.3 菌株致病性檢測

將純化培養(yǎng)的菌株用無菌水配制成菌懸液，調(diào)至105個(gè)·mL-1。將柑橘果實(shí)用2%次氯酸鈉溶液消毒2 min，清水洗凈，用消毒接種針在柑橘果實(shí)赤道處刺一個(gè)直徑3 mm、深3 mm的傷口，在傷口處分別接種20 μL孢子懸浮液，晾干，于25 ℃培養(yǎng)觀察果實(shí)發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，檢測菌株的致病性。

1.4 菌株傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察

將培養(yǎng)7 d的菌落，挑取邊緣菌絲放在滴有乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液的載玻片上，置于顯微鏡下觀察[10]。

1.5 菌株rDNA-ITS 序列分析

1.5.1 DNA的提取 將純化所得的6株菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），25 ℃、140 r·min-1培養(yǎng)3 d后，6000 r·min-1離心10 min，取少量菌絲，用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物有限公司）提取DNA，按說明書操作。

1.5.2 基因序列的測定 采用通用引物 ITS1 （5- TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3） 與 ITS4 （5- TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL（含15 mmol·L-1鎂離子），引物各1 μL，Taq酶 0.5 μL，模板DNA1 μL，用dd H2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送往上海生工生物有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.5.3 同源性分析 將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對，利用MEGA軟件對測序所得序列及GeneBank中選取的參比菌株的18S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11-12]。

1.6 丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑菌效果

根據(jù)致病性檢測結(jié)果選取P. digitatum和C. cladosporioides 2株菌進(jìn)行丁香精油抑菌效果的研究。用含1%（v/v）吐溫-80的無菌水將丁香精油分別稀釋為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 mL·L-1。參考楊紅等[13]的方法，無菌條件下，向培養(yǎng)皿里倒入9 mL 50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基，加入1 mL不同濃度的精油溶液，混勻，制得含丁香精油平板。待培養(yǎng)基凝固后，用直徑5 mm的無菌打孔器在生長3 d的菌落邊緣切取菌餅，接種至含丁香精油PDA培養(yǎng)基中心，于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，以不含丁香精油培養(yǎng)基生長的菌落作對照，測量空白組和處理組菌絲直徑，計(jì)算丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides菌絲生長的抑制百分率，以生長過程中無菌絲生長的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。每種處理5個(gè)平行，重復(fù)3次，取其平均值。

根據(jù)不同配比的抑制率，將抑制率換算成幾率值（y），藥劑體積分?jǐn)?shù)（mL·L-1）換成對數(shù)值（x），建立毒力回歸方程（y=b+ax），計(jì)算出對病原菌的抑制中濃度（ EC50） 。

菌絲抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。并利用MEGA 4.1對基因序列作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察

從寧波本地自然腐爛的柑橘果實(shí)上共分離出6株菌，分別記為A、B、C、D、E、F。菌株A在PDA培養(yǎng)基上菌落呈絨狀，圓形，基本上無氣生菌絲；菌絲開始為白色，逐漸變?yōu)榍嗑G色；基質(zhì)顏色為白色。顯微鏡觀察其菌絲頂端具有1～3 個(gè)分枝，掃帚狀；有分生孢子梗和分生孢子，且分生孢子無色，近球形（圖版-A）。

菌株B在PDA上的菌落邊緣不整齊，菌絲較長，初期為灰白色，逐漸長滿平皿，最終轉(zhuǎn)為灰褐色至黑色。鏡檢顯示分生孢子大都呈卵形，暗褐色，菌絲體不分枝，具隔膜（圖版-B）。

菌株C在PDA上菌落成絨狀，綠色，基質(zhì)顏色由綠色變?yōu)楹诨疑?；鏡檢觀察菌絲體不分枝，具隔膜，分生孢子為卵形（圖版-C）。

菌株D在PDA培養(yǎng)基上菌落呈粉粒狀，菌落較小邊緣清晰，菌絲體為墨綠色；鏡檢顯示分生孢子梗末端膨大成圓形，產(chǎn)生分生孢子（圖版-D）。

菌株E在PDA上菌落生長較快，呈液體狀，粉紅色，無菌絲。鏡檢觀察其菌體成卵圓形，分裂生殖（圖版-E）。

菌株F在PDA上菌落生長較快，菌落小且為白色，呈凸起狀，有特殊氣味。鏡檢觀察菌體為圓形（圖版-F）。

根據(jù)形態(tài)特征及鏡檢結(jié)果， 參照魏景超[14]的真菌鑒定手冊，初步判定的結(jié)果為： A為半知菌亞門青霉屬，B為半知菌亞門鏈格孢屬，C為半知菌亞門枝孢霉屬，D為半知菌亞門曲霉屬，E為擔(dān)子菌亞門鎖擲孢酵母屬，F(xiàn)為子囊菌亞門畢赤氏酵母屬。

2.2 菌株的致病性檢測

A菌株接種在柑橘果實(shí)后，1 d后開始發(fā)病，在果皮表面起始為水漬狀，之后快速形成白色菌絲，在果皮表面迅速擴(kuò)展，最后形成青綠色霉層。B菌株在柑橘表面形成干疤，病斑褐色，通常為圓型。C菌株侵染柑橘果實(shí)后，首先在表皮長出白色菌絲，接種3天后完全形成墨綠色霉層。D菌株在果皮及內(nèi)部形成病斑，開始為深褐色水漬狀病斑，逐漸長出白色菌絲，其后上生出大量的分生孢子最后形成墨綠色霉層。E菌株接種到柑橘果實(shí)后，果實(shí)未見明顯變化，7 d后傷口結(jié)疤。F菌株接種柑橘果實(shí)后，未見明顯發(fā)病癥狀。初步斷定A、B、C、D為柑橘采后病原菌，且A、C為導(dǎo)致柑橘腐爛的主要致病菌；E、F可能為酵母菌。

2.3 菌株rDNA-ITS 序列分析

將測序結(jié)果與GenBank 上已登錄的基因序列進(jìn)行比對，選取相近的參考菌株，利用MEGA4. 1 軟件基于18S rDNA 序列采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其進(jìn)化地位，結(jié)果如圖1所示。

從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，A與P. digitatum親緣關(guān)系較近，與 GenBank 中的基因序列比對后，A與P. digitatum的相似性為99%，因此，初步將A鑒定為P. digitatum。B與Alternaria citri在親緣關(guān)系上最近，經(jīng) GeneBank 中比對，基因序列相似性高達(dá)為99%，將B在分類學(xué)地位上歸于A. citri。C、D分別與C. cladosporioides和A. sydowii 聚在一起，親緣關(guān)系較近，可將其歸為C. cladosporioides和A. sydowii。E、F與S. pararoseus和P. caribbica的遺傳距離最近，在 GeneBank 中比對，相似性也分別達(dá)到99%和100%，因此，將其分別歸為S. pararoseus和P. caribbica。

結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征，綜合鑒定結(jié)果為：A為指狀青霉P. digitatum，B為柑橘鏈格孢A. citri，C為枝孢樣枝孢霉C. cladosporioides，D為聚多曲霉A. sydowii，E為近玫色鎖擲孢酵母S. pararoseus，F(xiàn)為卡利比克畢赤酵母P. caribbica。

2.4 丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑制中濃度（EC50）和最小抑制濃度（MIC）

從表1可以看出，丁香精油對P. digitatum有一定的抑制效果，且隨著丁香精油濃度的增加而增加。當(dāng)濃度為6 mL·L-1時(shí)，菌絲延伸量為0，此時(shí)為丁香精油對P. digitatum的最小抑制濃度（MIC）。通過計(jì)算各處理組的菌絲抑制率，建立毒力回歸方程為y=0.815 9x+1.045 1（R2=0.964 2），根據(jù)方程，計(jì)算出丁香精油對P. digitatum的抑制中濃度（EC50）為2.15 mL·L-1。

從表2可知，丁香精油對C. cladosporioides的抑制效果隨著濃度的增加而增加，其對C. cladosporioides的MIC為3 mL·L-1。計(jì)算各處理組的菌絲抑制率，建立毒力回歸方程為y=0.8159x+1.0451（R2=0.9642），得出丁香精油對C. cladosporioides的EC50為0.57 mL·L-1。結(jié)合兩表可以看出，丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑制效果不同，尤其對C. cladosporioides的抑制效果更佳。

3 討 論

由于rDNA- ITS 是介于5.8S rDNA、18S rDNA和28S rDNA 之間的區(qū)域，有研究表明ITS在真菌種內(nèi)不同菌株間高度保守可以為真菌的系統(tǒng)分類提供相應(yīng)的遺傳信息。而多數(shù)真菌菌落外觀不易描述，且其顯微結(jié)構(gòu)和菌落形態(tài)也會(huì)受到培養(yǎng)基等因素的影響發(fā)生不同或變異，單純依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類，結(jié)果不可靠。所以，現(xiàn)代分子學(xué)手段已發(fā)展應(yīng)用在檢測真菌病害或鑒定系統(tǒng)的領(lǐng)域內(nèi)[15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)可將菌株鑒定到屬，結(jié)合了rDNA- ITS分子標(biāo)記法，能將菌株鑒定到種的水平上。綜合所得，浙江寧海本地產(chǎn)柑橘采后主要致病菌為P. digitatum、A. citri、C. cladosporioides、A. sydowii。雖然國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為意大利青霉（P. italicum） 與指狀青霉（P. digitatum）是引起柑橘采后腐爛的主要致病菌，也有文獻(xiàn)[17]證實(shí)柑橘鏈格孢（A.citri）為柑橘致病菌，然而，可能由于產(chǎn)地、品種、管理?xiàng)l件、氣候等的不同，導(dǎo)致引起柑橘采后腐爛的致病菌發(fā)生了變化。

從柑橘上分離所得的卡利比克畢赤酵母（P. caribbica）在柑橘致病性檢測試驗(yàn)中柑橘在10 d后病斑與P. digitatum引起的病斑極相似，因此應(yīng)為柑橘發(fā)病中后期的病害拮抗菌，在短時(shí)間內(nèi)對致病菌有拮抗作用。有研究表明許多酵母菌對果蔬采后的病害具有抑制作用，酵母能夠產(chǎn)生葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等孢外水解酶可以分解病原菌的細(xì)胞壁或菌絲體從而破壞病原菌的生長代謝[18]。研究比較廣泛的拮抗酵母菌有隱球酵母屬、畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬等，其中畢赤氏酵母屬對柑橘[19]、櫻桃[20]、葡萄[21]等采后病害有明顯抑制效果，并且已應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)。而分離所得的近玫色鎖擲孢酵母（S. pararoseus）相關(guān)研究報(bào)道較少，是否為拮抗酵母有待于進(jìn)一步研究。

通過培養(yǎng)基加藥法研究了丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides的抑制效果。試驗(yàn)表明，丁香精油對這兩株菌有不同程度的抑制效果，由于不同菌種之間對丁香精油的耐受程度不同，所表現(xiàn)出來的抑制效果也不同。丁香精油的主要成分為丁香酚，含量高達(dá)60%。而植物精油一般作用于脂質(zhì)膜[22]，丁香酚與細(xì)胞膜中的磷脂發(fā)生反應(yīng)，影響膜的結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致生物體內(nèi)離子泄露，并且引起胞內(nèi)損傷從而抑制微生物的生長。目前對于植物精油的抑菌機(jī)理主要集中在細(xì)胞壁、膜的影響上，其更深層次的機(jī)理在今后仍需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和rDNA- ITS分子標(biāo)記法分析浙江寧海本地柑橘采后致病菌，同時(shí)研究丁香精油對主要致病菌的抑制作用。研究結(jié)果表明，柑橘上分離得到指狀青霉（P. digitatum）、柑橘鏈格孢菌（A. citri）、枝孢樣枝孢霉（C. cladosporioides）和聚多曲霉（A. sydowii）這4種致病菌；其中，優(yōu)勢腐敗菌為P. digitatum和C. cladosporioides。同時(shí)，分離出近玫色鎖擲孢酵母（S. pararoseus）和卡利比克畢赤酵母（P. caribbica）；丁香精油對P. digitatum和C. cladosporioides有較好的抑菌效果，抑制中濃度（EC50）分別為2.51 mL·L-1和0.57 mL·L-1；最小抑菌濃度（MIC）分別為6 mL·L-1和3 mL·L-1。說明丁香精油可以成為一種新的柑橘采后防腐保鮮方法，具有較大的商業(yè)應(yīng)用前景。（本文圖版見插1）

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