王海濤 嚴(yán)志焜 許林海 胡志斌 潘曉華

Gja5基因表達(dá)對小鼠下肢新生動(dòng)脈生成影響機(jī)制的研究

王海濤 嚴(yán)志焜 許林海 胡志斌 潘曉華

目的 研究Gja5基因表達(dá)在小鼠下肢新生動(dòng)脈生成中的保護(hù)作用。方法 將168只Gja5基因敲除小鼠分為CX40基因敲除實(shí)驗(yàn)組（Gja5-/-組），CX40雜合子組（Gja5+/-組）和對照組野生型小鼠（Gja5+/+組）3組，每組56只。另選擇增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的Gja5基因小鼠20只。在熒光顯微鏡下觀察EGFP標(biāo)記的Gja5基因在小鼠動(dòng)脈的表達(dá)，建立小鼠下肢股動(dòng)脈閉塞模型，應(yīng)用激光多普勒血流儀（LDF）動(dòng)態(tài)監(jiān)測股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)前，術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后1、3、7、14、21d下肢缺血區(qū)域的血流恢復(fù)情況，同時(shí)使用RT-PCR法檢測Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)。結(jié)果 EGFP標(biāo)記的Gja5基因（CX40基因）表達(dá)在小鼠的腦動(dòng)脈和股動(dòng)脈上。在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1、3、7、14、21d，Gja5-/-組小鼠的患肢血供較Gja5+/+組明顯減少。在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后3d時(shí)，Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)升高了約4倍，術(shù)后7d時(shí)逐漸回到基線水平。 結(jié)論 Gja5基因表達(dá)在小鼠下肢新生動(dòng)脈生成中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。

Gja5 基因 小鼠 下肢 新生動(dòng)脈生成

缺血性心血管疾病是目前發(fā)達(dá)國家及眾多發(fā)展中國家中成人最常見的死因之一[1]，所以新生動(dòng)脈生成和修復(fù)機(jī)制的研究對于缺血性心血管疾病具有重大意義。促進(jìn)代償性血管重建是富有前景的治療新策略[2]?？p隙連接（GJ）是含有多種細(xì)胞間通道的特殊膜結(jié)構(gòu)，容許離子、小分子代謝產(chǎn)物、第二信使等通過，是調(diào)節(jié)血管功能的一種關(guān)鍵因子[3-4]。GJ參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián)，進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞（GJIC），在細(xì)胞的生長、分化、生理功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[5-6]。體內(nèi)研究證實(shí)Gja5基因作為組成的跨物種和血管床的縫隙連接蛋白CX40，在血管壁細(xì)胞之間的耦合鏈接中發(fā)揮重要的作用，但Gja5基因縫隙連接蛋白CX40的具體調(diào)控機(jī)制尚不知曉[7]。本研究通過熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的Gja5基因在小鼠動(dòng)脈的表達(dá)，研究其在小鼠下肢新生動(dòng)脈生成中的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所有實(shí)驗(yàn)小鼠均來自于德國MDC生物醫(yī)學(xué)中心，清潔級。體重25～35（28.35±0.81）g，雌雄不拘；無人畜共患疾病，共188只。其中Gja5基因敲除小鼠（Gja5基因敲除組）168只，Gja5 EGFP小鼠（CX40 EGFP組）20只。將Gja5基因敲除組小鼠分為3個(gè)亞組：CX40基因敲除實(shí)驗(yàn)組（Gja5-/-組），CX40雜合子組（Gja5+/-組）和對照組野生型小鼠（Gja5+/+組），每組56只。1.1.2 建立小鼠下肢股動(dòng)脈閉塞模型（血流驅(qū)動(dòng)的新生動(dòng)脈生成動(dòng)物模型）（1）麻醉：采用氯胺酮100mg/kg（100mg/ml）和甲苯噻嗪10mg/kg（20mg/ml）行腹腔注射麻醉，麻醉完成后小鼠平臥在操作臺上，局部溫度保持37℃，雙足采用膠布固定，雙眼使用眼藥膏保護(hù)。（2）手術(shù)：小鼠右腹股溝手術(shù)區(qū)使用脫毛霜脫毛，70%乙醇消毒。平行股動(dòng)靜脈方向行皮膚切口0.5cm，確定股神經(jīng)，股動(dòng)脈和股靜脈血管神經(jīng)束。暴露股動(dòng)脈、股靜脈和股神經(jīng)，并小心分離。根據(jù)Hoefer[8]的方法雙重結(jié)扎股動(dòng)脈。多數(shù)情況下的近端旋股動(dòng)脈和側(cè)尾鰭股動(dòng)脈緊密相連。于這兩個(gè)分支的近端第1次結(jié)扎，兩個(gè)分支遠(yuǎn)端第2次結(jié)扎。在第2次結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)端位置，股動(dòng)脈分為隱動(dòng)脈和腘動(dòng)脈，最后縫合手術(shù)切口（圖1）。

圖1 小鼠手術(shù)示意圖

1.2 方法

1.2.1 激光多普勒血流成像技術(shù)（LDF）評估血流灌注情況 采用英國Moor設(shè)備有限公司的MoorLDI2-HR高分辨率成像儀。股動(dòng)脈被結(jié)扎后，采用非侵入性的LDF動(dòng)態(tài)監(jiān)測下肢缺血區(qū)域的血流恢復(fù)情況。其中多普勒信號與皮膚上直徑為200～300μm的血管內(nèi)血流灌注量成正比。比較對側(cè)（非結(jié)扎側(cè)）的肢體，研究區(qū)域組織灌注的量化，顯示為彩色編碼的圖像。結(jié)合肢體灌注的其他測量措施，從足部獲得相關(guān)的彩色編碼的圖像。小鼠被麻醉后，應(yīng)用LDF動(dòng)態(tài)監(jiān)測并記錄股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)前、術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后1、3、7、14、21d下肢缺血區(qū)域的血流灌注量。血流灌注量的單位以PU表示。

1.2.2 Real-time RT-PCR檢測 在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后7d，以頸椎脫臼法處死Gja5+/+組和Gja5+/-組小鼠各8只，從股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)和非結(jié)扎側(cè)的大腿和下肢剝離皮膚和筋膜，分離和切除腓腸肌，立即冷凍在液氮中并儲存于-80℃冰箱。采用Trizol試劑提取腓腸肌的總RNA?；诘聡鳥ioTez有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TaqMan探針，開始進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測。并根據(jù)使用說明書，通過TaqMan基因表達(dá)MasterMix序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)被重復(fù)測試3次。甘油磷酸鹽脫氫酶被正常化后，計(jì)算mRNA的相對值。采用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針序列。

1.2.3 Real-time RT-PCR檢測 Gja5小鼠實(shí)時(shí)RTPCR法（5′to 3）正向引物：CAGCCTGGCTGAACTCTACCA。反向引物：CTGCCGTGACTTGCCAAAG。Taq-Man探針：CGCTGTCGGATCTTCTTCCAGCCCAG。Gja5基因敲除小鼠基因型引物（5′to 3）正向引物：TGGAGCCACAGTTGCAATGGT。反向引物（Gja5-/-組）：TCTCTGACTCCGAAAGGCAG。反向引物（Gja5-/-組）：GCACGAGACTAGTGAGACGTG。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示。Gja5-/-組和Gja5+/+組的組間比較、Gja5+/-組和Gja5+/+組的組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Gja5基因的表達(dá) Gja5基因在小鼠的腦動(dòng)脈Willis環(huán)上（圖2）和在小鼠的股動(dòng)脈上（圖3）的表達(dá)。

圖2 Gja5基因在小鼠的腦動(dòng)脈Willis環(huán)上的表達(dá)

圖3 Gja5基因在小鼠的股動(dòng)脈上的表達(dá)

2.3 Gja5+/+組、Gja5-/-組及Gja5+/-組 3組間通過LDF成像比較下肢缺血區(qū)域的血流灌注量，結(jié)果見表1。3組術(shù)后3d和7d下肢缺血區(qū)域的血流灌注圖像，見圖4、5。

由表1可見，在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)前，Gja5+/+，Gja5+/-及Gja5-/-3組之間的患肢血供差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1、3、7、14、21d，Gja5+/+組與Gja5-/-組比較，小鼠的患肢血供恢復(fù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而Gja5+/+組和Gja5+/-組比較，小鼠的患肢血供恢復(fù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá) Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)顯示為結(jié)扎側(cè)/非結(jié)扎側(cè)的比值。在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后3d，Gja5基因在Gja5+/+和Gja5+/-兩組間腓腸肌的表達(dá)均升高了約4倍（4.015±0.036，4.241±0.125），股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后7d，其表達(dá)均逐漸回到基線水平（1.0）。Gja5+/+和Gja5+/-兩組的Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組通過LDF成像比較下肢缺血區(qū)域的血流灌注量（PU）

圖4 股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后3d各組LDF灌注圖像

圖5 股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后7d各組LDF灌注圖像

3 討論

當(dāng)前冠心病的治療仍依賴各類藥物擴(kuò)張血管，此種方法不能阻斷病程的發(fā)展，最后往往不得不施行血管再通或旁路搭橋手術(shù)。由于再通后的冠狀動(dòng)脈及移植的旁路血管易再次阻塞且不適于病變廣泛的病例，所以這類手術(shù)的應(yīng)用受到一定的限制。外周血管栓塞性疾病如血栓閉塞性脈管炎由于缺乏有效的治療方法，使很多患者付出了截肢的代價(jià)。血管重建包括血管發(fā)生、血管新生及動(dòng)脈生成，是機(jī)體在血管閉塞狀態(tài)下的病理生理性代償反應(yīng)。以改善缺血為目的，應(yīng)用促血管因子、基因治療和血管祖細(xì)胞補(bǔ)充治療已成為當(dāng)前缺血性血管疾病治療的研究熱點(diǎn)[9-10]。動(dòng)脈生成是指由于動(dòng)脈阻塞，血流再分配使側(cè)支微動(dòng)脈血流量增加、血管內(nèi)剪切力增加，引起細(xì)胞增殖、血管重塑，從而形成大的有功能的側(cè)支動(dòng)脈的過程，所形成的動(dòng)脈能夠有效地恢復(fù)動(dòng)脈阻塞所致缺血區(qū)的血液供應(yīng)[11-15]。側(cè)支動(dòng)脈生成比血管新生更重要，促進(jìn)側(cè)支動(dòng)脈生成，恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)及改善組織細(xì)胞的氧和營養(yǎng)物質(zhì)供給，能夠全面的治療缺血性血管疾病，它將成為缺血性血管疾病治療的發(fā)展方向[16]。

GJ是含有多種細(xì)胞間通道的特殊膜結(jié)構(gòu)，每個(gè)GJ由來自相鄰細(xì)胞膜上的2個(gè)縫隙連接半通道，也稱為連接子組成，每個(gè)連接子由6個(gè)連接蛋白分子構(gòu)成6聚體蛋白質(zhì)，中間包繞水相孔道，形成一個(gè)在相鄰細(xì)胞漿可進(jìn)行離子和小分子物質(zhì)交換的孔道和低阻的電沖動(dòng)通道[17]。GJ在血管發(fā)育和血管功能中發(fā)揮了多方面的作用，也參與了神經(jīng)發(fā)生和血管生成[18]。

為了證實(shí)Gja5基因在新生動(dòng)脈形成中的調(diào)節(jié)作用，我們使用Gja5基因突變小鼠，并建立血流驅(qū)動(dòng)的新生動(dòng)脈形成模型，股動(dòng)脈閉塞模型[8]。在一個(gè)特定的位點(diǎn)結(jié)扎股動(dòng)脈，從而觸發(fā)了結(jié)扎點(diǎn)近端小的且預(yù)先存在的側(cè)支動(dòng)脈轉(zhuǎn)化成有功能的新生動(dòng)脈，以及遠(yuǎn)端的缺血性血管新生。下肢缺血后的血管反應(yīng)，可以很容易地被LDF和新生動(dòng)脈形成的組織學(xué)的指標(biāo)來評估。本研究中，通過熒光顯微鏡觀察EGFP標(biāo)記的Gja5基因在小鼠動(dòng)脈的表達(dá)。使用Gja5 EGFP小鼠，我們可以發(fā)現(xiàn)Gja5基因表達(dá)在小鼠的腦動(dòng)脈Willis環(huán)和股動(dòng)脈上。通過LDF檢測，我們發(fā)現(xiàn)在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1～21d，Gja5+/+組和Gja5-/-組小鼠的患肢血供恢復(fù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Gja5+/+組和Gja5+/-組小鼠的患肢血供恢復(fù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從而認(rèn)為Gja5基因在新生動(dòng)脈生成中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能，可作為動(dòng)脈標(biāo)記物。在股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后3d，Gja5基因在腓腸肌的表達(dá)升高了4倍，股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后7d，在缺血后肢，無論是在Gja5+/-小鼠和Gja5+/+小鼠，其表達(dá)水平均逐漸恢復(fù)到基線水平。有趣的是，Pipp等[19]在豬的缺血后肢新生動(dòng)脈生成模型中發(fā)現(xiàn)非常高的流體切應(yīng)力（FSS）水平和豐富的側(cè)支循環(huán)，從而表明了FSS的重要性，通常情況下，在以后各階段的動(dòng)脈生成中，隨著新生動(dòng)脈的直徑增大，F(xiàn)SS逐漸下降至正常水平，可防止新生動(dòng)脈直徑進(jìn)一步增長，從而達(dá)到最佳適應(yīng)。Pipp等[19]發(fā)現(xiàn)，在他們的動(dòng)靜脈分流模型中，進(jìn)一步持續(xù)升高FSS，可顯著增加新生動(dòng)脈的直徑大小，由此，我們可以發(fā)現(xiàn)，Gja5基因表達(dá)在股動(dòng)脈閉塞模型上的變化趨勢與FSS在動(dòng)脈生成上的變化趨勢是相同的，從而確立了FSS是新生動(dòng)脈生成的激發(fā)因素。因此，我們認(rèn)為，Gja5在新生動(dòng)脈生成中發(fā)揮了重要的職能作用，但需要進(jìn)一步的研究股動(dòng)脈閉塞后Gja5表達(dá)和FSS變化之間的關(guān)系。另外Gja5表達(dá)在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)可能影響到患肢灌注減少。因此，要研究這個(gè)功能的參與，我們也需要進(jìn)一步研究在小鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞特異性的基因敲除Gja5基因的表達(dá)。Gja5在新生動(dòng)脈生成中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能，可作為動(dòng)脈標(biāo)記物。

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Relationship between Gja5 gene expression and arteriogenesis in mouse hindlimb

Objective To investigate the relationship between the gene expression of Gja5(connexin-40,CX-40)and arteriogenesis on the hindlimb in mice．Methods One hundred and sixty eight mice were used in the study,including 56 CX40 knockout mice(Gja5-/-group)，56 CX40 heterozygous mice(Gja5+/-group)and 56 wild-type mice(Gja5+/+group)．The hindlimb blood flow blockage was induced by femoral arteries occlusion(FAO)．The scanning Laser Doppler Flow Imager was used to observe the expression of Gja5 in Gja5 EGFP reporter animals through fluorescent microscope．Gja5 gene expression was also detected in gastrocnemicus（GC）muscle by real-time RT-PCR before and 1,3,7,14,21d after FAO．Results The Gja5 gene was expressed in mouse arteries including cerebral artery and femoral artery．There were significant reductions for hindlimb perfusion in Gja5-/-mice compared to Gja5+/+mice at d1,3,7,14 and 21 after FAO．The expression levels of Gja5 in Gja5+/-mice and Gja5+/+mice in GC muscle were both increased 4-fold in the ischemic hindlimb at d3 after FAO．Then the expression levels of Gja5 returned to baseline values at d7 after FAO．Conclusion Arterial Gja5 expression may be involved in the arteriogenesis of ischemic hindlimb of mice．

Gja5 Gene Mice Hindlimb Arteriogenesis

2012-08-23）

（本文編輯：楊麗）

浙江省錢江人才計(jì)劃D類項(xiàng)目（QJD1202017），浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺重點(diǎn)資助計(jì)劃項(xiàng)目（2013ZDA003）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院心胸外科

王海濤，E-mail：wanght1974@hotmail.com