馬偉斌 江榮林 雷澍 王靈聰 吳建濃 黃立權(quán) 吳艷春 智屹惠朱美飛

參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠心血管功能和心肌氧化應(yīng)激的改善作用

馬偉斌 江榮林 雷澍 王靈聰 吳建濃 黃立權(quán) 吳艷春 智屹惠朱美飛

目的 觀察參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠心血管功能和心肌氧化應(yīng)激的改善作用。 方法 采用結(jié)扎穿孔盲腸法制備腹腔感染膿毒癥動(dòng)物模型。將180只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組、膿毒癥（CLP）組、參附注射液低劑量（LSF）組、參附注射液高劑量（HSF）組，每組各20只。記錄手術(shù)后6、18 h各組的平均動(dòng)脈壓（MAP）、心率（HR）、左室收縮壓（LVDP）和左室最大收縮速率（+dP/dt）、左室舒張壓（LVEDP）和左室最大舒張速率（-dP/dt）、心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率（AI）、心臟組織丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、呼吸控制比（RCR）。 結(jié)果 與Sham組比較，CLP組術(shù)后6h時(shí)的HR顯著升高（P＜0．05），但術(shù)后18h時(shí)的HR有所降低（P＜0．01）；術(shù)后6、18h的MAP、LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt、SOD、RCR均顯著下降（均P＜0．01），AI、MDA均顯著升高（P＜0．05或0．01）。而與CLP組比較，LSF組術(shù)后6h的MAP和HR、HSF組術(shù)后6h的HR差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05），但HSF組術(shù)后6h的MAP及LSF、HSF組術(shù)后18h的HR、MAP均明顯升高（P＜0．05或0．01）；LSF組和HSF組術(shù)后6、18h的LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt、SOD、RCR均顯著升高（P＜0．05或0．01）；LSF組和HSF組術(shù)后6、18h的AI、MDA均顯著降低（P＜0．05或0．01）。結(jié)論 參附注射液可改善膿毒癥大鼠的左室收縮和舒張功能，減少心肌細(xì)胞凋亡和心肌組織MDA含量，增加SOD活性，保護(hù)線粒體功能，且這些作用的強(qiáng)度與參附注射液藥物劑量成正比。

參附注射液 膿毒癥 大鼠 心血管 氧化應(yīng)激

膿毒癥是臨床常見的危重癥，主要表現(xiàn)為血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定和組織細(xì)胞氧代謝障礙，極易發(fā)展為膿毒癥休克和多臟器功能障礙綜合征（MODS）。目前臨床上仍未找到有效方法阻斷其發(fā)生、發(fā)展，且療效不佳，病死率高達(dá)45%～70%。參附注射液是經(jīng)典的益氣溫陽類藥物，是一種以紅參、附片為主要成份的中成藥，具有回陽救逆、益氣固脫的作用，主要用于陽氣暴脫的厥脫癥等（感染性、失血性、低血容量性休克等），尤其是膿毒性休克危重狀態(tài)下的急救。筆者通過觀察參附注射液對(duì)膿毒癥模型大鼠心血管功能和心肌氧化應(yīng)激的影響，探討其改善重度膿毒癥患者氧代謝異常的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只，體重200～250g，平均（223±21）g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠均自由覓食水。參附注射液（主要成份：紅參、黑附片提取物）由四川雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z2004-3117，50ml/瓶）；3%戊巴比妥鈉由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心配置；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；蛋白酶K、0.3%H2O2甲醇溶液、核苷酸和脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶混和液、辣根過氧化物酶等均為國產(chǎn)分析純。低溫離心機(jī)（Eppendorf公司，5804型），恒溫水浴箱（Heto-Holten公司，SBD50型），紫外分光光度計(jì)（上海生化儀器廠），MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）。

1.2 方法 采用結(jié)扎穿孔盲腸法制備重度膿毒癥休克模型。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組、膿毒癥（CLP）組、參附注射液低劑量（LSF）組、參附注射液高劑量（HSF）組，每組各20只。Sham組：僅行開腹手術(shù)，但不結(jié)扎穿孔盲腸。CLP組：開腹手術(shù)后結(jié)扎穿孔盲腸，10min后經(jīng)股靜脈微量泵推注0.9%氯化鈉注射液10ml/kg。HSF組：開腹手術(shù)后結(jié)扎穿孔盲腸，10min后經(jīng)股靜脈微量泵推注參附注射液10ml/kg。LSF組：開腹手術(shù)后結(jié)扎穿孔盲腸，10min后經(jīng)股靜脈微量泵推注0.9%氯化鈉注射液5ml/kg與參附注射液5ml/kg。

1.3 監(jiān)測指標(biāo) 將每組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法再分為兩組，每組各10只，分別于手術(shù)后6、18h記錄相關(guān)指標(biāo)。

1.3.1 大鼠血壓的記錄和左室功能評(píng)價(jià) 予3%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，行股動(dòng)脈插管，通過壓力傳感器連接于MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，記錄平均動(dòng)脈壓（MAP）。行左心室插管，通過MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄左室收縮曲線，并記錄心電圖。計(jì)算心臟收縮功能指標(biāo)左室收縮壓（left ventricular developed pressure，LVDP）、左室最大收縮速率（+dP/dt），心臟舒張功能指標(biāo)左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室最大舒張速率（-dP/dt）以及心率（HR）等指標(biāo)。

1.3.2 凋亡細(xì)胞的檢測 采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色檢測凋亡的發(fā)生。心肌標(biāo)本用10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。將組織切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，37℃下用蛋白酶K處理30min后再用PBS緩沖液（phosphate buffered saline）沖洗；0.3%H2O2甲醇溶液室溫下孵育30min，PBS緩沖液沖洗后加入用熒光標(biāo)記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的混和液，37℃水浴箱中反應(yīng)60min，PBS緩沖液沖洗；加辣根過氧化物酶孵育30min（37℃），PBS緩沖液沖洗；DAB顯色（避光），蘇木素復(fù)染后脫水，透明，封片。在高倍鏡下（10×40）檢測，凋亡陽性細(xì)胞核呈棕黃色，凋亡陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色。以凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的百分比作為細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.3.3 心肌組織MDA含量的測定 采用硫代巴比妥酸法測定。取10%左心室勻漿上清液，依次加入試劑盒中的試劑，旋渦混勻器混勻，置沸水浴40min，離心取上清液，蒸餾水調(diào)零，于532nm處測OD（optical density）值。采用考馬斯亮藍(lán)法[1]測定組織的蛋白含量，計(jì)算各組大鼠心臟MDA的含量。

1.3.4 心肌組織SOD活性的測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取左心室，使用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液在冰浴下制成10%組織勻漿液，離心取上清液備用。使用紫外可見光分光光度計(jì)，讀取440nm下各組吸光度。用考馬斯亮藍(lán)法測定組織的蛋白含量。

1.3.5 線粒體提取 心臟置于預(yù)冷的分離介質(zhì)中（pH 7.4，10mmol/L Tris-HCl緩沖液，250mmol/L蔗糖，0.5mmol/L乙二胺四乙酸和0.5%牛血清白蛋白）剪碎后勻漿。勻漿液經(jīng)離心（1 000r/min，10min）后，棄沉淀物。取上清液，再離心（10 000r/min，10min），棄上清液。取沉淀物用分離介質(zhì)重懸后再離心（10 000轉(zhuǎn)/min，10min），所得沉淀即為提取的細(xì)胞線粒體。

1.3.6 線粒體呼吸控制比（RCR）測定 RCR反映線粒體氧化磷酸化功能。參照Poderoso等[2]使用的方法，以蘋果酸鈉和谷氨酸鈉為底物，采用Clark電極測定心肌線粒體ST3（state 3）、ST4（state 4）氧耗速率，計(jì)算RCR= ST3/ST4。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化 見表1。

表1 4組大鼠心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

2.1.1 MAP的變化 CLP組大鼠手術(shù)后6、18 h MAP較Sham組明顯下降；LSF組6h MAP與CLP組無明顯差異，但18h MAP較CLP組有顯著提高；HSF組6、18h時(shí)的MAP均較CLP組明顯提高，說明參附注射液可以提升膿毒癥時(shí)已降低的血壓。

2.1.2 HR和心功能的改變 CLP組大鼠手術(shù)后6h HR較Sham組顯著增高，而手術(shù)后18 h時(shí)HR卻明顯下降。LSF、HSF組6h時(shí)HR與CLP組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有下降的趨勢；而18h時(shí)LSF、HSF組的HR較CLP組有所提高。CLP組大鼠手術(shù)后6、18h時(shí)的LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt較Sham組均明顯降低。LSF、HSF組6、18h時(shí)LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt較CLP組均有明顯提高，表明參附注射液能不同程度地改善膿毒癥時(shí)異常的HR及左心室收縮和舒張功能。

2.1.3 心肌細(xì)胞凋亡的測定 與Sham組比較，CLP組大鼠手術(shù)后6、18h心肌細(xì)胞AI均明顯增加。LSF、HSF組于6、18h的心肌細(xì)胞AI均較CLP組顯著降低，說明參附注射液可減少膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡。

2.1.4 心肌MDA和SOD的測定 與Sham組比較，CLP組大鼠手術(shù)后6、18h心肌MDA含量均顯著增加，SOD活性則明顯降低。手術(shù)后6、18h時(shí)，LSF、HSF組心肌MDA含量較CLP組均有明顯降低，而SOD含量則有所升高，提示參附注射液能糾正膿毒癥心肌細(xì)胞異常的脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，并提高其清除氧自由基的能力。

2.2 4組大鼠心肌線粒體RCR的比較 見表2。

表2 4組大鼠心肌線粒體RCR的比較

由表2可見，與Sham組比較，大鼠CLP手術(shù)后6、18h心肌細(xì)胞RCR均顯著降低。LSF、HSF組于6、18h的線粒體RCR較CLP組顯著升高，提示參附注射液能顯著改善心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)的氧代謝過程。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，重度膿毒癥患者的器官功能障礙主要是功能性而非器質(zhì)性的，由于其線粒體功能障礙導(dǎo)致組織氧耗量降低[3-5]，使組織細(xì)胞進(jìn)入乏氧代謝的過程，繼而導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙。江榮林等[6]研究發(fā)現(xiàn)重度膿毒癥患者使用參附注射液后，其氧供、氧耗和乳酸清除率得到明顯提高，組織氧代謝顯著改善。但這些結(jié)果均是通過臨床研究發(fā)現(xiàn)的，具體機(jī)制尚未明確。

現(xiàn)代藥理研究顯示，參附注射液內(nèi)所含人參皂苷、烏頭類生物堿、人參多糖等，能改善心肌缺血，清除氧自由基，減輕心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度，保護(hù)心肌細(xì)胞[7]。去甲烏頭堿具有擬異丙腎上腺素的作用，能增強(qiáng)心肌收縮力，提高竇房結(jié)和房室結(jié)興奮性，加速房室傳導(dǎo)，從而加快HR[8]。人參皂苷具有促進(jìn)前列腺素的釋放和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈作用，可通過提高心肌組織cAMP/ cGMP比值而產(chǎn)生增強(qiáng)心肌收縮力，減慢HR[9]。徐志清等[10]研究亦發(fā)現(xiàn)參附注射液能有效改善急性心肌梗死后的左心功能，進(jìn)一步證實(shí)了參附注射液的上述作用。

在重度膿毒癥和膿毒性休克時(shí)，由于受到體內(nèi)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的TNF-α、IL-6、心肌抑制因子等炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的影響，心肌常常處于抑制狀態(tài)，使心血管功能受到較大的抑制。MAP是心血管功能的綜合指標(biāo)，LVDP、+dP/dt是心臟收縮功能的指標(biāo)，LVEDP、-dP/dt是心臟舒張功能的指標(biāo)，這些參數(shù)均能良好地反映心血管功能。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP組大鼠手術(shù)后6、18h MAP明顯下降（P＜0.01），而參附注射液低、高劑量可不同程度地增高CLP大鼠的MAP，說明參附注射液有提高膿毒癥大鼠MAP的作用，且這一作用與參附劑量成正相關(guān)。楊芳炬等[11]研究也發(fā)現(xiàn)參附注射液可增加冠脈血流量，降低周圍血管阻力，從而達(dá)到升高血壓的目的。本研究中，CLP組大鼠術(shù)后6h HR顯著加快，術(shù)后18h下降，心臟收縮、舒張功能均減弱。各劑量參附注射液對(duì)膿毒癥6h時(shí)增快的HR尚不足以產(chǎn)生明顯影響（P＞0.05），但有使其降低的作用趨勢；而對(duì)18h時(shí)過慢的HR有明顯的提升作用。低、高濃度的參附注射液均能顯著改善CLP手術(shù)引起的LVDP、+dP/dt、LVEDP、-dP/dt降低，且這一作用與參附注射液的濃度成正比，說明參附注射液確實(shí)能夠改善受到抑制的心血管功能，有利于維護(hù)血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，有利于膿毒性休克的抗休克治療。

諸多報(bào)道認(rèn)為，心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生與否受Fas/ FasL、Bcl-2家族、Caspase家族等因素的調(diào)控[12-15]。本研究中CLP組大鼠術(shù)后6、18h心肌AI均明顯高于Sham組，LSF、HSF組在一定程度上也可降低AI，且與濃度成正比，說明膿毒癥時(shí)確實(shí)存在心肌細(xì)胞凋亡增多的現(xiàn)象，而參附注射液對(duì)此有一定的抑制作用。張曉膺等[16]研究也發(fā)現(xiàn)參附注射液對(duì)缺氧誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用，考慮可能與參附注射液具有抑制caspase-3蛋白酶活性的作用有關(guān)，但其詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，CLP組大鼠手術(shù)后6、18h心臟MDA含量顯著增加，而SOD活性明顯降低，說明膿毒癥時(shí)存在著顯著的脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，但清除氧自由基的能力則明顯不足。低、高濃度的參附注射液均可顯著減少CLP大鼠心臟組織MDA含量，增加SOD活性，說明不同濃度的參附注射液均可顯著抑制脂質(zhì)過氧化并提高其清除氧自由基的能力，且這種作用與劑量成正比，反映了參附注射液對(duì)膿毒癥時(shí)組織氧自由基損傷的保護(hù)作用。

RCR是評(píng)價(jià)線粒體完整性和氧化磷酸化偶聯(lián)程度的靈敏指標(biāo)，其下降表明線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)程度降低，線粒體功能受損[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠CLP手術(shù)后6、18h心臟RCR顯著下降（P＜0.01），說明膿毒癥時(shí)存在著顯著的線粒體功能損傷；而使用低、高濃度參附注射液后大鼠RCR的下降均得到有效控制，且此作用強(qiáng)度與參附注射液的劑量成正比，從而顯著改善線粒體內(nèi)的氧代謝過程，提高氧化供能的能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥時(shí)應(yīng)用參附注射液可有助于心血管功能的改善和心肌氧化應(yīng)激異常的恢復(fù)，且這些作用的強(qiáng)度與參附注射液藥物劑量成正比，從而糾正膿毒癥的病理生理狀態(tài)，為膿毒癥的治療提供了新的途徑。但本研究尚未涉及膿毒癥模型大鼠的最終預(yù)后，且本研究結(jié)果的深層次分子生物學(xué)機(jī)制亦不清楚，尚需進(jìn)一步深入研究。

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Effects of ShenFu Injection on cardiovascular function and myocardial oxidative stress in rats with sepsis

Objective To investigate the effects of ShenFu Injection(SF)on cardiovascular function and myocardial oxidative stress in rats with sepsis．Methods A total of 80 Sprague-Dawley(SD)rats were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture(CLP),and were randomly divided into four groups:sham operation group(n=20),sepsis group(n=20),low-SF group (n=20)and high-SF group(n=20)．Mean arterial pressure(MAP),heart rate(HR),left ventricle developed pressure(LVDP)and maximal rate of the left ventricular pressure increase(+dP/dt),left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)and maximal rate of the left ventricular pressure decrease(-dP/dt),apoptosis incidence of myocardial cells(AI),heart tissue malondialdehyde(MDA) content,superoxide dismutase (SOD)activity and respiratory control ratio (RCR)of each group were recorded 6h and 18h after the surgery．Results Compared to Sham group,HR in CLP group increased significantly 6h after surgery(P＜0．05),but decreased significantly 18h after surgery(P＜0．01)．Compared with Sham group,MAP,LVDP,+dP/dt,LVEDP,-dP/dt,SOD and RCR in CLP group all decreased significantly 6h and 18h after surgery(P＜0．01),AI and MDA increased significantly 6h and 18h after surgery(P＜0．05 or 0．01)．Compared with sepsis group,no significant differences were found in MAP and HR of LSF group 6h after surgery,and also in HR of HSF group 6h after surgery(P＞0．05)．Compared to sepsis group,MAP in HSF group 6h after surgery,HR and MAP in both LSF and HSF groups 18h after surgery all increased significantly(P＜0．05 or 0．01)．Compared to sepsis group,LVDP,+dP/dt,LVEDP,-dP/dt,SOD and RCR in both LSF and HSF groups increased significantly(P＜0．05 or 0．01) 6h and 18h after surgery．Compared to sepsis group,AI and MDA in both LSF and HSF groups decreased significantly(P＜0．05or 0．01)． Conclusion ShenFu Injection can improve heart function,decrease myocardial apoptosis,reduce myocardial MDA content,enhance SOD activity and protect mitochondrial function in septic rats．The effects are related to the dose of ShenFu Injection．

ShenFu Injection Sepsis Rats CardiovascularOxidative stress

2012-11-12）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)推薦）

浙江省中醫(yī)藥科研基金計(jì)劃項(xiàng)目（2008CA017）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科（馬偉斌），ICU（江榮林、雷澍、王靈聰、吳建濃、黃立權(quán)、吳艷春、智屹惠、朱美飛）

江榮林，E-mail:jiangronglin@126.com