王兆豐 葛志堅 鮑軼 邵平揚 陳松勁 阮玲娟

HIV患者外周血CD4+/CD25hi/ CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的表達及臨床意義

王兆豐 葛志堅 鮑軼 邵平揚 陳松勁 阮玲娟

目的 探討感染人類自身免疫缺陷病毒（HIV）患者抗病毒治療前后外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的表達情況及臨床意義。 方法 選擇符合HIV診斷標準、接受抗病毒治療超過3個月的64例患者，采用高效抗逆轉錄病毒治療（HARRT），分別于治療前、治療3個月后采用流式細胞術檢測外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞和CD4+T細胞的表達情況，并與80例健康體檢者（對照組）比較。結果與對照組比較，HIV患者CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)及百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。HIV患者的CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)和CD4+T細胞呈正相關（P＜0．01）；HIV患者治療3個月后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞均有升高，與治療前的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．01）。根據(jù)年齡將患者分為18～30歲、31～45歲、＞45歲，各年齡段患者治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)分別是治療前的4．28倍、3．00倍、2．00倍。結論HIV患者外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的表達與病毒的感染、清除有關；外源性藥物可升高調(diào)節(jié)性T細胞的表達。

調(diào)節(jié)性T細胞 HIV感染 高效抗逆轉錄病毒治療

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate peripheral blood CD4+/CD25hi/CD127lowRegulatory T cell（Treg）levels in HIV patients after antiviral therapy and its clinical significance．MethodsSixty four HIV patients,including 18 cases aged 18～30,35 cases aged 30～45 and 11 cases aged＞45 received highly active antiretroviral therapy(HAART)．CD4+/CD25hi/CD127lowTreg and CD4+T cells in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)were determined by flow cytometry before and 3 months after HAART．Eighty healthy individuals served as controls．ResultsBefore HAART the circulating Treg levels in HIV patients were significantly lower than those in controls(8±2．20,33±10．03,P＜0．01)．Treg was positively correlated with CD4+cells in PBMCs(r=0．81,P＜0．01)of HIV patients．The circulating levels of Treg were increased 3 months after HAART(P＜0．01);the degree of Treg cell elevation was associated with the age of patients:4．28-fold for 18～30 age group,3-fold for 30～45 age group and 2-fold for＞45 age group,respectively．ConclusionHighly active antiretroviral therapy can increase the CD4+/CD25hi/CD127lowTreg levels in HIV patients,which may be associated with the reduction of viral load．

機體感染人類自身免疫缺陷病毒（HIV）后可引發(fā)全身性的免疫失調(diào)，表現(xiàn)為CD4+T細胞的進行性減少以及調(diào)節(jié)性T細胞和效應T細胞之間的免疫失衡[1]。調(diào)節(jié)性T細胞是具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，能抑制自身免疫疾病的發(fā)生，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中有一定作用[2]。CD127是調(diào)節(jié)性T細胞表面標志物，CD127的表達對T淋巴細胞的成熟、維持及免疫應答發(fā)揮著重要作用。CD4+T細胞是HIV攻擊的主要細胞，當CD4+T細胞＜200個/μl時，免疫系統(tǒng)遭到徹底破壞，免疫功能極度低下。筆者通過測定HIV患者治療前后CD4+T細胞和CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)及百分比，探討HIV患者的發(fā)病機制和對外源性藥物的免疫應答情況。

1 對象和方法

1.1 對象 嘉興市2005-01—2011-12符合HIV診斷標準[3]、在嘉興市疾控中心接受免費艾滋病抗病毒治療超過3個月的64例患者，男59例，女5例；年齡18～68歲，平均（39.88±9.89）歲。所有患者HIV抗體初篩、確證試驗（WB）均為陽性，CD4+T細胞＜200個/μl，臨床診斷為艾滋病期，由本人同意并簽訂《抗艾滋病病毒藥物治療同意書》后登記并錄入國家艾滋病抗病毒藥物治療數(shù)據(jù)庫提供的《治療基本情況表》。選擇2011-01—06在嘉興學院醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院健康體檢者80例作為對照組，其中男55例，女25例，年齡18～62歲，平均（36.88± 9.09）歲。

1.2 儀器與試劑 流式細胞儀采用美國BD FACSCantoⅡ流式細胞儀FACSDiva軟件，以BD Calibrite七色校準微球試劑對儀器進行校準；試劑為CD4-PECY5/CD25-FITC/CD127-PE，同型對照為gG1-FITC/ IgG1-PE/IgG1-PECY5，均為美國BD公司生產(chǎn)。

1.3 方法 所有患者均使用高效抗逆轉錄病毒治療（HARRT）。藥物使用國家提供的核苷類反轉錄酶抑制劑藥物（NRTIs），包括齊多夫定（AZT）、拉米夫定（3TC）、司他夫定（D4T）、替諾福韋（TDF），以及非核苷反轉錄酶抑制劑類藥物（NNRTs），包括奈韋拉平（NVP）、依非韋侖（EFV）[4]。每種治療方案均包含3種抗病毒治療藥物,其中2種核苷類反轉錄酶抑制劑和1種非核苷類反轉錄酶抑制劑[5]。分別于治療前和治療3個月后檢測外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞和CD4+T細胞絕對計數(shù)和百分比。測定步驟：使用含EDTA-K2的真空采血管采集受試對象靜脈血，對照管加入IgG1-FITC/ IgG1-PE/IgG1-PECY5 20μl，測定管加入CD4-PECY5/ CD25-FITC/CD127-PE 20μl，分別加入100 μl的枸櫞酸鈉（EDTA）抗凝新鮮全血，室溫避光孵育20min，采用CoulteRQ-PREP溶血儀溶血后上流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間及治療前后的比較采用t檢驗，CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞與CD4+T細胞的相關性分析采用Pearson相關系數(shù)。

2 結果

2.1 兩組治療前CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)及百分比的比較 CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)HIV患者（8.00±2.20）個/μl，對照組（33.00± 10.03）個/μl，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。CD4+/ CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞百分比HIV患者（2.67± 0.69）%，對照組（6.53±4.11）%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞與CD4+T細胞呈正相關（r=0.81，P＜0.01），見圖1。

圖1 HIV患者CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞與CD4+T細胞的相關性

2.2 HIV患者治療前后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的比較 根據(jù)年齡將HIV患者分為18～30歲18例，其中男16例，女2例；30～45歲35例，其中男33例，女2例；＞45歲11例，其中男10例，女1例。各年齡段HIV患者治療3個月后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)及百分比明顯升高，治療前后的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞和CD4+T細胞絕對計數(shù)是治療前的3.09倍、1.93倍，治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)是治療前的4.28倍、3.00倍、2.00倍，治療后CD4+T細胞絕對計數(shù)是治療前的2.30倍、2.09倍、1.41倍，見表1、圖2、3。

表1 HIV患者治療前后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的比較

3 討論

最近有研究發(fā)現(xiàn)，CD127可以作為記憶性T細胞及調(diào)節(jié)性T細胞特異性的表面標記物，這對效應性T細胞向記憶性T細胞的轉化、維持及調(diào)節(jié)性T細胞功能的進一步研究提供了重要工具，也為病毒感染的研究及治療的進一步發(fā)展提供了重要信息[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)HIV患者治療前CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)和百分比均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；HIV患者CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)與CD4+T細胞絕對計數(shù)呈正相關，說明HIV病毒感染可能與IL-7的特異性應答有關，而IL-7在病毒感染后的免疫應答及病毒特異性CD4和CD8記憶性T細胞庫的產(chǎn)生及維持過程中發(fā)揮重要作用[7]。

圖2 流式細胞圖（P3：CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞；A：治療前；B：治療后）

圖3 各年齡段患者治療前后T細胞絕對計數(shù)的比較（A：CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞；B：CD4+T細胞）

本研究中治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞和CD4+T細胞絕對計數(shù)是治療前的3.09倍和1.93倍。各年齡段HIV患者HARRT治療后CD4+/CD25hi/ CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)與治療前的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），治療后CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)分別是治療前的4.28倍、3.00倍、2.00倍，提示年輕患者比年老患者的CD4+/CD25hi/ CD127low調(diào)節(jié)性T細胞絕對計數(shù)升高幅度更大、對外源性藥物免疫應答更強。CD127信號對DN期胸腺細胞的幸存和增殖起著必不可少的作用。Buckley[8]發(fā)現(xiàn)在CD127基因敲除的小鼠中，胸腺細胞的數(shù)量明顯減少，T細胞和B細胞功能嚴重缺陷，而在人類中由于CD127缺陷引起的嚴重聯(lián)合免疫缺陷病則僅表現(xiàn)為T細胞功能缺陷。CD127作為IL-7的受體，在T淋巴細胞的發(fā)育、T細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持及記憶性T細胞的分化及幸存等方面發(fā)揮重要的作用，在T細胞缺乏的條件下，CD127信號可以不依賴T細胞抗原受體（TCR）刺激T細胞增殖，促進T細胞數(shù)量的恢復。臨床表明，抗病毒治療可以有效地抑制HIV的復制，減輕HIV對免疫系統(tǒng)功能的損傷，并達到免疫重建的功效，減少患者機會性感染和腫瘤的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量[9]。筆者發(fā)現(xiàn)HIV病毒感染患者中調(diào)節(jié)性T細胞CD127表達減少，可能影響T淋巴細胞的存活及功能，在治療方面，基于IL-7可以通過CD127刺激外周非同種異基因反應性T細胞的增殖，并通過抗凋亡作用保證T細胞的幸存，恢復外周T細胞數(shù)量，促進外周T淋巴細胞的重構，維持T細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[10]。

綜上所述，HIV患者外周血CD4+/CD25hi/CD127low調(diào)節(jié)性T細胞的表達與病毒的感染、清除有關；外源性藥物可升高調(diào)節(jié)性T細胞細胞的表達。

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Peripheral CD4+/CD25hi/CD127lowTreg cell levels in HIV patients after antiviral therapy and its significance

Treg HIV infection Highly active antiretroviral therapy

2013-01-18）

（本文編輯：嚴瑋雯）

314000 嘉興學院醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院中心實驗室（王兆豐、鮑軼、邵平揚、陳松勁、阮玲娟）；嘉興市疾控中心檢驗科（葛志堅）

葛志堅,E-mail:phgzj@163.com