何 泉，羅海明，朱寶生，唐新華，蔣綠芝

血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)是新發(fā)現(xiàn)的分泌性內(nèi)皮細胞特異性糖蛋白生長因子，與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)一樣是血管內(nèi)皮家族中的成員。分子量約為70 kD，基因定位于染色體的8p23，cDNA編碼496個氨基酸，在血管內(nèi)皮中表達。糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，DN發(fā)生、發(fā)展的確切機制不明，目前研究認為與糖代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、細胞因子、遺傳背景等多種因素綜合作用有關(guān)。近來Anuradha等[1]研究發(fā)現(xiàn)Ang-2在2型糖尿病(T2DM)、糖耐量異常(IGT)以及無空腹血糖升高的代謝綜合征患者中高表達，導(dǎo)致血清Ang-2水平升高。本研究通過比較T2DM患者、DN患者及健康者Ang-2 A1087G的基因頻率和等位基因頻率以及血清Ang-2水平，從而探討Ang-2 A1087G基因多態(tài)性與T2DM腎病的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年1月—2012年1月云南省第一人民醫(yī)院、昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的T2DM患者1 021例(T2DM組)，均符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病診斷標準，且排除心力衰竭、慢性腎小球疾病、腎盂腎炎、慢性腎衰竭等DN以外的腎臟疾病及糖尿病酮癥酸中毒、高滲性昏迷，排除治療期間使用排泄藥物者。T2DM組中男506例，女515例；平均年齡(58.5±9.4)歲。另選取同期在同一醫(yī)院體檢無糖尿病、腎病家族史及腎功能正常的健康者254例(NC組)，其中男119例，女135例；平均年齡(46.7±8.9)歲。兩組受檢者均為昆明地區(qū)無血緣關(guān)系的漢族人。

根據(jù)T2DM組患者尿清蛋白排泄率(unrinal albuminuric excretion rate，UAER)，進一步將T2DM患者分為3組：(1)T2DM無DN組(DN0組，431例)：2次測定UAER<30 mg/24 h，病程至少5年以上。其中男199例，女232例；平均年齡(59.7±10.4)歲。(2)T2DM合并微量蛋白尿組(DN1組，322例)：2次測定30 mg/24 h≤UAER<300 mg/24 h。其中男155例，女167例；平均年齡(61.7±11.9)歲。(3)T2DM合并大量蛋白尿組(DN2組，268例)：2次測定UAER≥300 mg/24 h；其中男119例，女149例；平均年齡(62.7±12.5)歲。NC組、DN0組、DN1組、DN2組受檢者性別構(gòu)成及平均年齡間有均衡性。

1.2 主要實驗試劑和儀器 DNA提取試劑盒(Omega，USA)，PCR反應(yīng)引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕；Taq酶、dNTP與DNA Mark〔寶生物工程(大連)有限公司〕；限制性內(nèi)切酶(NEB)；PCR產(chǎn)物測序(上海博亞生物技術(shù)有限公司)；BIO-RAD PCR儀(USA)。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 記錄所有受檢者的身高、體質(zhì)量、血壓、腰圍、臀圍，計算體質(zhì)指數(shù)(BMI)和腰臀比；采用簡化的MDRD方程計算腎小球濾過率(eGFR)，eGFR(ml·min-1·1.73 m-2)=186×Scr(mg/dl)-1.154×年齡(歲)-0.203(女性×0.7/42)，Scr為血肌酐；測定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)，按穩(wěn)態(tài)模型評估法計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=FINS×FBG/22.5)及胰島β細胞功能指數(shù)〔HOMA-IS=20×FINS/(FBG-3.5)〕；用酶聯(lián)免疫吸附法測定單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)；用比色法測定UAER；用氧化酶法測定血糖；用酶法測定血脂(三酰甘油、總膽固醇)；用離子交換高壓液相色譜法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)。

1.3.2 DNA制備 EDTA抗凝抽取外周血3 ml，嚴格按DNA提取試劑盒說明書制備基因組DNA，紫外分光光度計分別測A260 nm、A280 nm，確定純度為1.6～1.8，DNA工作濃度為100 ng/μl。

1.3.3 PCR擴增 引物制備參考文獻[2]。上游引物：5′-CAT TAG AAT AGC CTT CAC-3′，下游引物：5′-GAG TGA TTA CTG ACT AAA GG-3′。共20 μl的反應(yīng)體系內(nèi)含：10×Buffer(含Mg2+) 3.5 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/L) 0.2 μl，引物(10 μmol/L)4 μl，DNA模板3 μl，雙蒸水8.3 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 45 s，退火50 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，35次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用Eco571酶(5 U/μl)酶切，于37 ℃溫育23 h，取特異性擴增產(chǎn)物10 μl和載樣緩沖液(溴酚藍)1 μl混勻，上樣。電壓150 V，電泳90 min，紫外分析儀下觀察電泳結(jié)果并攝像。

1.3.4 電泳 擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳方法進行分析，銀染后判斷基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性。計量資料以(x--±s)表示，多組間計量資料比較采用方差分析，若P<0.05再進行組間兩兩比較，采用q檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；發(fā)病危險因素采用兩變量間的Pearson相關(guān)分析及Logistic回歸分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增及酶切結(jié)果 經(jīng)限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析，PCR產(chǎn)物用Eco571酶酶切后發(fā)現(xiàn)了Ang-2第4外顯子+1087位點的3種基因型：AA、AG和GG型。AA基因型有1個片段(250 bp)，AG基因型有3個片段(250 bp、150 bp、110 bp)，GG基因型有2個片段(150 bp、110 bp)。各基因型的電泳圖見圖1。

2.2 各組Ang-2基因型和等位基因頻率 各組受檢者Ang-2 A1087G的基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中DN0組、DN1組、DN2組患者Ang-2 A1087G的AG+GG基因型頻率和G等位基因頻率與NC組比較，DN1組、DN2組與DN0組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，見表1)。

2.3 各組受檢者的臨床生化指標比較 各組受檢者的血脂、BMI、腰臀比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而血壓、HbA1c、eGFR、FBG、FINS、HOMA-IS、HOMA-IR、MCP-1、Ang-2水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中DN0組、DN1組、DN2組患者血壓、HbA1c、eGFR、FBG、FINS、HOMA-IS、MCP-1、Ang-2水平與NC組比較，DN1組、DN2組HOMA-IR與NC組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DN1組、DN2組的血壓、eGFR、FBG、HOMA-IS、HOMA-IR、MCP-1水平與DN0組比較，DN2組Ang-2水平與DN0組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且DN2組的eGFR、HOMA-IS、HOMA-IR與DN1組比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.4 T2DM患者Ang-2 A1087G與MCP-1的相關(guān)性分析 DN0組Ang-2 A1087G攜G基因型(AG+GG)與MCP-1呈正相關(guān)(r=0.578，P=0.012)；DN1組、DN2組患者Ang-2 A1087G攜G基因型(AG+GG)與MCP-1呈正相關(guān)(r=0.628，P=0.011；r=0.843，P=0.003)。在固定性別、年齡、BMI等后，Pearson相關(guān)分析表明Ang-2 A1087G攜G基因型(AG+GG)與HOMR-IR呈正相關(guān)(r=0.264，P<0.05)。

2.5 糖尿病并發(fā)腎病危險因素的分析 以DN發(fā)生為因變量，選擇Ang-2基因型或等位基因及臨床指標為自變量做Logistic回歸分析，結(jié)果顯示Ang-2 A1087G的AG+GG基因型、等位基因G、血清Ang-2水平、收縮壓、HbA1c、FBG、MCP-1、HOMA-IS、eGFR進入回歸方程(見表3)。

校正年齡、性別、糖尿病病程、HbA1c、血壓等因素影響后，AG+GG基因型相對AA基因型發(fā)生DN0(即T2DM無DN)的危險性增加1.823倍〔95%CI(1.557，4.221)，P=0.011〕，G等位基因發(fā)生DN0的風(fēng)險是A等位基因的1.442倍〔r=1.321，OR=1.442，95%CI(2.320，4.178)，P=0.030〕；發(fā)生DN1(即T2DM合并微量蛋白尿)的危險性增加1.778倍〔95%CI(2.356，5.220)，P=0.010〕，G等位基因發(fā)生DN1的風(fēng)險是A等位基因的1.984倍〔r=1.021，OR=1.984，95%CI(2.621，4.574)，P=0.027〕；發(fā)生DN2(即T2DM合并大量蛋白尿)的危險性增加1.991倍〔95%CI(3.560，6.229)，P=0.001〕，G等位基因發(fā)生DN2的風(fēng)險是A等位基因的1.881倍〔r=1.338，OR=1.881，95%CI(3.321，5.173)，P=0.001〕。

圖1 Ang-2 A1087G PCR-RFLPR產(chǎn)物電泳圖

Figure1 The electropherogram of PCR-RFLP of Ang-2 A1087G produces

表1 4組受檢者Ang-2 A1087G基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of Ang-2 A1087G genotype and allele frequencies among four groups

組別例數(shù)基因型頻率AA AG+GG等位基因頻率A GNC組254187(75 6) 67(24 4) 411(80 9) 97(19 1) DN0組431263(61 0)168(39 0)? 536(77 2)158(22 8)? DN1組322187(58 1)135(41 9)?△449(69 7)195(30 3)?△DN2組268148(55 2)120(44 8)?△356(66 4)180(33 6)?△χ2值14 3249 221P值0 0210 032

注：與NC組比較，*P<0.05；與DN0組比較，△P<0.05

表2 4組受檢者臨床及生化指標比較(x--±s)Table 2 Comparison of clinical and laboratory parameters in four groups

注：HbA1c=糖化血紅蛋白，BMI=體質(zhì)指數(shù)，eGFR=腎小球濾過率，F(xiàn)BG=空腹血糖，F(xiàn)INS=空腹胰島素，HOMA-IR=胰島素抵抗指數(shù)，HOMA-IS=胰島β細胞功能指數(shù)，MCP-1=單核細胞趨化蛋白1，Ang-2=血管生成素2；與NC組比較，*P<0.05；與DN0組比較，△P<0.05；與DN1組比較，▲P<0.05

表3 T2DM患者并發(fā)腎病危險因素的Logistic回歸分析結(jié)果

Table3 The multiple Logistic regression analysis of dangerous factors for patients with T2DM complicated with diabetic nephropathy

自變量βOR值95%CIP值A(chǔ)ng-2A1087G(AG+GG)基因型0 7321 801(2 532，4 318)0 010Ang-2A1087G等位基因G1 2971 432(2 311，4 893)0 031血清Ang-2水平1 5430 971(1 224，2 678)0 035收縮壓0 6121 038(1 251，3 480)0 023HbA1c0 3571 312(2 157，4 439)0 015FBG0 4120 422(0 807，1 443)0 021MCP-10 7211 201(2 117，3 337)0 021HOMA-IS0 4361 256(2 733，4 109)0 012eGFR1 1221 012(2 277，3 889)0 040

3 討論

近年來，糖尿病導(dǎo)致的終末期腎病(ESRD)發(fā)病率顯著增加，且已逐步成為ESRD的主因。有研究顯示，即使長期嚴格控制血糖，仍有20%～40%的糖尿病患者最終發(fā)展為糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)[3]。DN是糖尿病微血管并發(fā)癥之一。DN和糖尿病視網(wǎng)膜病變都存在血管生成異常，DN早期腎小球肥大，毛細血管袢擴張，尿清蛋白排泄增多；晚期微血管大量退縮，腎組織缺血缺氧最終導(dǎo)致腎小球酸化和腎間質(zhì)纖維化。已有研究表明，糖尿病微血管病變與多種血管生長因子的作用失衡有關(guān)[4]。Ang-2是近年發(fā)現(xiàn)的一類新的血管發(fā)生相關(guān)蛋白因子，在腎臟的基因表達主要與3種內(nèi)皮損傷特征相關(guān)，即微血管瘤形成、內(nèi)皮炎性浸潤和泡沫化變形。DN的發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮功能障礙及許多因子的異常表達密切相關(guān)[5]，而UAER正是反映腎臟血管內(nèi)皮細胞損傷的標志性指標。本研究發(fā)現(xiàn)DN0組、DN1組、DN2組Ang-2水平顯著高于NC組，且DN2組Ang-2水平又顯著高于DN1組，提示Ang-2水平有隨著UAER的增加而升高的趨勢；Ang-2可能通過損傷腎臟血管內(nèi)皮細胞使腎小球毛細血管的滲透性增加導(dǎo)致蛋白尿，從而引發(fā)DN。這與顧衛(wèi)紅等[6]的研究發(fā)現(xiàn)Ang-2水平與尿蛋白/肌酐值呈正相關(guān)的結(jié)論相一致。血管發(fā)生異常在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著極為重要的作用。在分析DN基因表達譜，尋找DN相關(guān)基因時，鄭敬民等[7]觀察到DN患者腎小球中Ang-2基因的表達水平明顯升高，并且發(fā)現(xiàn)在基因芯片所包含的總共7個Ang家族成員中，僅Ang-2呈差異性表達，故推測其可能是一個有價值的DN發(fā)病相關(guān)基因。本研究結(jié)果顯示，NC組、DN0組、DN1組及DN2組Ang-2 A1087G攜G等位基因的個體(AG+GG)基因型頻率逐漸升高，G等位基因頻率在4組間亦有顯著差異，這進一步證實Ang-2 G1087可能是DN發(fā)生發(fā)展的遺傳易感基因。

近年來炎癥在DN中的作用受到人們的重視，眾多炎性細胞因子、黏附因子、趨化因子和生長調(diào)節(jié)因子等相互作用、相互交聯(lián)，擴大了炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，促進了DN的進展。在機體的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，炎癥的產(chǎn)生及發(fā)揮作用主要通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的基因，從而改變炎癥相關(guān)下游效應(yīng)蛋白的表達及活性，進而參與DN的炎癥過程。Ang-2是內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的自分泌調(diào)節(jié)因子，促進了內(nèi)皮細胞對腫瘤壞死因子α(TNF-α)的敏感度和TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞黏附分子表達[8]。Ang-2可使內(nèi)皮細胞的連接失去穩(wěn)定性，促進炎癥細胞的滲出；另一方面，TNF-α也可上調(diào)Ang-2的表達[6]。本研究發(fā)現(xiàn)NC組、DN0組、DN1組及DN2組血清MCP-1水平逐漸升高，且DN0組Ang-2 A1087G AG+GG基因型與MCP-1呈正相關(guān)，DN1組、DN2組Ang-2 A1087G攜G等位基因與MCP-1呈正相關(guān)，更加證明Ang-2與炎癥存在相關(guān)性。

DN不僅與遺傳有關(guān)，還與其他多種原因有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，DN1組、DN2組FBG水平及HOMA-IR顯著高于DN0組，HOMA-IS顯著低于DN0組，說明β細胞功能明顯下降，機體處于較高的血糖狀態(tài)。高血糖通過蛋白激酶C(PKC)途徑使NADPH氧化酶的活性增加，機體產(chǎn)生較多的活性氧自由基，進一步加重腎臟損害，從而導(dǎo)致DN較易發(fā)生[9]。高血糖還使細胞內(nèi)丙酮醛增多，后者通過共價修飾Ang-2啟動子結(jié)合蛋白mSin3A而直接調(diào)節(jié)Ang-2基因轉(zhuǎn)錄[10]。

在對2型糖尿病合并腎臟病變的多因素分析中，發(fā)現(xiàn)Ang-2 A1087G的AG+GG基因型、G等位基因、Ang-2水平、收縮壓、HbA1c、FBG、MCP-1、HOMA-IS、eGFR與DN的發(fā)生有關(guān)。血清Ang-2水平是Ang-2基因表達的結(jié)果，Ang-2在血管內(nèi)皮表達造成血管內(nèi)皮損傷從而使得糖尿病微血管發(fā)生病變導(dǎo)致DN的發(fā)生；在病情由DN0向DN2的發(fā)展進程中，HbA1c、收縮壓可互為因果關(guān)系；eGRF則是DN發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)——微血管病變的結(jié)果；FBG水平對微血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激的觸發(fā)起到很大的作用；MCP-1是否是介導(dǎo)了微血管內(nèi)皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生從而使糖尿病腎臟血管內(nèi)皮的凋亡導(dǎo)致DN的發(fā)生尚待進一步研究；HOMA-IS的升高表明胰島β細胞衰竭，導(dǎo)致胰島素分泌減少，血糖升高，所起的作用與FBG所起的作用有異曲同工之效。

綜上所述，Ang-2 A1087G攜G等位基因的糖尿病患者易發(fā)展為DN，G等位基因是DN發(fā)生的獨立危險因素，結(jié)合微量蛋白尿的檢測和eGFR的檢測，可以更早期、更有效地對該類患者進行預(yù)防和治療。炎癥參與了DN的發(fā)病，為DN的治療提供理論依據(jù)。目前關(guān)于Ang/酪氨酸激酶受體(Tie)的研究方興未艾，Ang在血管生成相關(guān)疾病中有廣闊的應(yīng)用前景，若能在DN早期正確干預(yù)，促進新生血管發(fā)育成熟、穩(wěn)定及降低血管滲透，晚期預(yù)防微血管結(jié)構(gòu)進行性破壞，則有望為阻止或延緩DN進展提供新的契機和方法。

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