孔令勝，靳 峰，郭 強，張 浩，胡亞偉

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)對機體造成災難性的后果，表現(xiàn)為損傷節(jié)段平面以下感覺、運動功能完全喪失和大小便失禁。由于缺乏有效的治療方法，世界各國均把SCI的臨床治療作為一項難題及科研重點。神經(jīng)干細胞(NSCs)具有自我增殖能力和多向分化潛能，在神經(jīng)損傷修復方面有著良好的應用前景[1-3]，NSCs移植已成為治療SCI新的研究熱點[4-6]，但對移植后神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和皮質(zhì)體感誘發(fā)電位(CSEP)的變化研究少。本研究旨在動態(tài)觀察NSCs移植對大鼠SCI后NSE和CSEP的影響，從而為NSCs移植治療SCI提供理論和物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年健康雄性清潔級SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±20)g(徐州醫(yī)學院實驗動物中心)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)抗體(Sigma)，基礎細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12，1∶1,Hyclone)，B27復合物(Gibco)，成纖維細胞生長因子(bFGF)，表皮樣生長因子(EGF，Invitrogen)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，多聚賴氨酸(Sigma)，巢蛋白(Nestin)抗體(Sigma)，NSE抗體(Sigma)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液體(Boster)，二步法免疫組化試劑盒(Zymed)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學純。自行研制的電控SCI自動打擊裝置。NDI-200海神號神經(jīng)電檢診儀(上海海軍醫(yī)學研究所)。

1.2 方法

1.2.1 胚胎大鼠NSCs的分離培養(yǎng)和鑒定以及移植細胞的制備分別參見參考文獻[7]和[8]進行。

1.2.2 大鼠SCI模型的制作及分組 SD大鼠40只按隨機數(shù)字表法分為Brdu+NSCs組、NSCs組、SCI組和假手術組(Sham組)，每組10只。Sham組僅做椎板切開術。SCI組：戊巴比妥鈉溶液(0.5 ml/100 g)腹腔麻醉后，將大鼠固定于立體定位儀上，以第13肋為標志沿后正中線切開，咬除T13～L1椎板暴露脊髓，固定T12、L2椎體，以T13棘突相對應的脊髓后正中血管為中心用電磁程控鐵棒下落打擊裝置損傷脊髓，打擊力量為10×2.5 g·cm。NSCs組：神經(jīng)干細胞植入損傷脊髓組。Brdu+NSCs組：Brdu標記的神經(jīng)干細胞移植組。大鼠死亡及時復制模型補充。

1.2.3 脊髓內(nèi)NSCs移植 造模成功后即刻參考Miura等[9]方法行NSCs移植。大鼠麻醉后固定于立體定位儀上，原切口進入，在平T13棘突處硬脊膜背側正中血管旁1 mm處輕輕挑開硬脊膜成一縱行小口，用漢密爾頓微量注射器，向頭側呈45°角進針，深度1.5 mm，將細胞濃度為2×105/μl的NSCs懸液5 μl、0.9%氯化鈉溶液5 μl分別注入NSCs組、SCI組，10 min內(nèi)完成注射，保留5 min后退出。

1.2.4 CSEP檢查 參照人類CSEP檢測和記錄的方法，在室溫25 ℃的實驗室中，大鼠腹腔麻醉，刺激電極置于內(nèi)踝脛后神經(jīng)上，陽極置遠心端，小腿部皮下接地，記錄電極置于顱表相當于人類的中央?yún)^(qū)(Cz)，參考電極置于前額區(qū)(FPz)，電極阻抗<5 kΩ，帶通范圍30～1 500 Hz，分析時間50 ms，刺激頻率3 Hz，刺激強度為引起趾的輕微收縮，疊加500 次，每次檢查至少重復2次，以求獲得較好的重復性[10]。CSEP檢測結束行組織病理學取材觀察。

1.2.5 蘇木素-伊紅(HE)染色、Brdu及NSE免疫組織化學染色 NSCs移植后第1、3、7、14、28 天取材，大鼠在深麻醉下，以0.4%多聚甲醛行心臟灌流固定，取損傷段脊髓，在30%蔗糖磷酸鹽緩沖液中沉底后，用冷凍切片機自SCI處做連續(xù)橫切片，片厚30 μm，切片收集于裝有0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液的細胞培養(yǎng)板的兩孔中，依次留片，每孔中留片15張。行常規(guī)HE染色及按二步法免疫組織化學試劑盒操作步驟進行Brdu、NSE免疫化學染色。

1.2.6 圖像分析 采用LEICA QWin圖像處理與分析系統(tǒng)進行分析。在200倍鏡下計數(shù)脊髓沿中央導水管橫線以前NSE陽性細胞數(shù)；在400倍鏡下選擇不重疊的5個視野計算NSE陽性細胞灰度。

2 結果

2.1 皮質(zhì)體感誘發(fā)電位-P波(CSEP-P)檢測結果 Sham組大鼠在各時間點CSEP-P潛伏期為17～18 ms，經(jīng)比較左右兩下肢測量的結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，統(tǒng)一選擇右下肢的測量結果。4組間各時間點CSEP-P潛伏期比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Sham組和SCI組各時間點間CSEP-P潛伏期比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而Brdu+NSCs組和NSCs組各時間點間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中SCI組、NSCs組和Brdu+NSCs組各時間點CSEP-P潛伏期與Sham組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；NSCs組和Brdu+NSCs組除第1天外余各時間點與SCI組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Brdu+NSCs組與NSCs組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。排除了Brdu對實驗結果的影響。

2.2 移植NSCs在脊髓內(nèi)的存活及遷移 Brdu陽性細胞呈時間依賴性變化趨勢[8]：Brdu陽性細胞在移植術后第7天可檢測到，為棕黃色核標記的小圓形細胞，沿移植穿刺針道呈串珠狀排列，Brdu陽性細胞平均每高倍鏡視野陽性細胞數(shù)為(7.3±1.7)個；第14天移植細胞在臨近損傷區(qū)逐漸增多，陽性細胞數(shù)為(18.4±3.0)個(t=10.245，P<0.01)，且向移植針道周圍遷移可達1.1 cm；移植術后第28天陽性細胞逐漸減少并消失，其余各組無陽性細胞。

2.3 脊髓HE染色的光鏡觀察 Sham組大鼠脊髓灰質(zhì)運動神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞的細胞輪廓清楚，胞核清晰，部分細胞可見核仁，呈鳥眼樣。SCI組損傷后第1天，脊髓背側可見缺損區(qū)域，灰質(zhì)結構破壞，白質(zhì)中可見有腫脹的軸突和大量的空泡。SCI后第3天及第7天灰質(zhì)和白質(zhì)中部分細胞形態(tài)改變，突起減少，膠質(zhì)細胞增生。SCI后第14～28天，損傷范圍更為明確，脊髓變細并有空洞形成，膠質(zhì)細胞瘢痕形成。Brdu+NSCs組移植后第1天，脊髓中可見出血灶，灰質(zhì)結構破壞，尼氏體減少，細胞體積減?。坏?天及第7天損傷達高峰，殘留細胞數(shù)量相對較多。SCI后第14天及第28天，損傷部位殘留細胞形態(tài)大致正常，尼氏體增加。Brdu+NSCs組與NSCs組之間比較病理學改變無明顯差異(見圖1、2)。

2.4 NSE免疫組織化學染色結果分析 NSE主要存在于神經(jīng)元的胞質(zhì)中。4組間各時間點NSE 免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Sham組各時間點間NSE 免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而SCI組、Brdu+NSCs組和NSCs組各時間點間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中SCI組、NSCs組和Brdu+NSCs組各時間點NSE 免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數(shù)與Sham組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；NSCs組和Brdu+NSCs組除第1天外余各時間點與SCI組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Brdu+NSCs組與NSCs組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2、表3)。NSE免疫陽性細胞灰度值及陽性細胞數(shù)與CSEP-P潛伏期均呈負相關(r=-0.937，P<0.001；r=-0.956，P<0.001)。

表1 4組各時間點CSEP-P潛伏期比較Table 1 Comparison of the latency of CSEP-P wave at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

圖1 SCI組移植后第7天(A)與移植后第28天(B)的HE染色(A：×100，B：×40)Figure 1 HE staining 7 d(A) and 28 d(B)after transplantation in SCI group

表2 4組各時間點NSE 免疫陽性細胞灰度值比較Figure 2 Comparison of the grey level of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

表3 4組各時間點NSE免疫陽性細胞數(shù)比較Table 3 Comparison of NSE immunostaining positive cells at each time point in four groups

注：與Sham組比較，▲P<0.01；與SCI組比較，*P<0.01

3 討論

中樞神經(jīng)再生問題一直是神經(jīng)科學界在理論研究和臨床實踐上感到十分困惑且尚未找到有效治療方法的重大難題。因而外傷導致中樞神經(jīng)的損害尤為嚴重，諸如腦皮質(zhì)功能受損或消失、SCI所致的癱瘓等[11-13]。NSCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中保持分裂和分化潛能的細胞，NSCs移植已成為人們探索治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的新途徑，有研究報道，NSCs移植能在挫傷腦組織存活、遷移，并促進宿主神經(jīng)元存活、局部軸突再生和改善腦挫傷大鼠神經(jīng)功能[14]。Brdu是胸腺苷類似物，可通過堿基互補配對的原則整合到處于S期的原始干細胞雙鏈DNA中，在半保留復制過程中逐漸消減。本研究將Brdu標記的NSCs移植到大鼠SCI區(qū)，并于移植后第7天、第14天檢測到逐漸增多的Brdu陽性細胞，移植細胞沿移植穿刺針道排列并發(fā)生了遷移，以上結果表明移植的NSCs可以存活于SCI區(qū)并向SCI區(qū)域發(fā)生了遷移，從而為下一步深入研究奠定了基礎。

CSEP是連續(xù)刺激外周感覺神經(jīng)纖維在中樞神經(jīng)系統(tǒng)誘發(fā)的綜合電位活動，其變化可反映出脊髓神經(jīng)功能受損的程度，能夠客觀、量化和敏感地評價感覺功能障礙[15]。研究證實，脊髓后索和后外側索是CSEP傳導的主要通路。由于脊髓前后索相鄰，又為同一軟脊膜包繞，故CSEP也能間接反映前索情況，說明CSEP與后肢運動功能之間存在一定聯(lián)系。CSEP的波幅變化個體變異非常大，而潛伏期變化比較恒定，且與損傷程度及功能狀態(tài)的相關性也較大；潛伏期能夠反映神經(jīng)纖維傳導速度，潛伏期延長說明神經(jīng)纖維傳導阻滯，潛伏期縮短說明神經(jīng)纖維傳導速度增快，脊髓神經(jīng)傳導功能恢復[16]，故本研究只檢測了潛伏期的變化。結果表明，Brdu+NSCs組與NSCs組CSEP潛伏期除移植后第1天外其余各時間點均較SCI組顯著縮短，提示NSCs移植能夠促進SCI后神經(jīng)傳導功能的恢復，可能的作用機制是NSCs移植入損傷脊髓后能從細胞結構上與宿主融合，遷移分化成特定的神經(jīng)元，分泌細胞因子，一方面上調(diào)與軸索生長相關的基因，促進受損的神經(jīng)元軸索再生；另一方面，與其他的神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，重建神經(jīng)環(huán)路，達到SCI的功能性恢復。

烯醇化酶普遍存在于哺乳動物組織中，其同工酶以αα、ββ、γγ、αγ、αβ 5種形式存在于細胞質(zhì)中，γγ型特異性地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中(線粒體內(nèi))，故命名為NSE[17]。NSE含量由高到低依次位于腦、脊髓、周圍神經(jīng)節(jié)，一旦缺血或受損，神經(jīng)元胞體和軸突的細胞膜完整性發(fā)生變化，使細胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)(包括NSE)迅速進入細胞間隙，胞內(nèi)的NSE減少，同時在腦脊液和血液內(nèi)可以檢測到NSE。本研究觀察到SCI組損傷后NSE免疫陽性細胞灰度值和陽性細胞數(shù)明顯減少，第3天開始緩慢恢復，同時伴有CSEP-P潛伏期的緩慢縮短，提示NSE的表達不僅能反映脊髓神經(jīng)損傷的程度，而且也參與了SCI后的修復過程，是脊髓感受傷害性反應的內(nèi)源性保護劑，但這種自發(fā)的內(nèi)源性的保護作用是有限度的。Brdu+NSCs組與NSCs組除移植后第1天外，各時間點NSE免疫陽性細胞灰度值均高于SCI組，陽性細胞數(shù)亦多于SCI組，HE染色亦觀察到移植后第28天損傷部位殘留細胞形態(tài)大致正常，尼氏體增加。相關分析表明，NSE免疫陽性細胞灰度值越高、陽性細胞數(shù)越多，SCI后CSEP-P潛伏期縮短越明顯，結果提示，NSCs移植能明顯上調(diào)SCI后NSE的表達，并能通過促進NSE的表達而縮短CSEP-P潛伏期，從而減輕SCI、保護神經(jīng)功能，進而促進大鼠后肢神經(jīng)功能障礙的恢復，具體的調(diào)控機制尚待進一步深入研究。

綜上所述，體外培養(yǎng)的NSCs移植到SCI區(qū)域后可存活、遷移，且能明顯上調(diào)SCI后NSE的表達，并能通過促進NSE的表達而縮短CSEP-P潛伏期，從而促進大鼠后肢功能障礙的恢復。但以上結果與Sham組相比仍有一定差距，表明單純NSCs并不能得到十分滿意的脊髓功能恢復，因而尋求多種方法的聯(lián)合運用治療SCI將是我們繼續(xù)研究的課題和努力的方向。

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