局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是一個病理形態(tài)學(xué)診斷名詞，其發(fā)病機制尚未完全明確，尤其是循環(huán)因子在FSGS發(fā)病中的研究結(jié)果更是莫衷一是。循環(huán)因子在FSGS發(fā)病中的作用很早就為人們所關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者在腎移植術(shù)后原發(fā)病可很快復(fù)發(fā)[1]，但復(fù)發(fā)FSGS即行血漿置換可有效減少蛋白尿[2，3]，F(xiàn)SGS復(fù)發(fā)患者的血漿注射大鼠后可誘發(fā)蛋白尿[4-6]。離體功能實驗證實FSGS患者血漿可增加腎小球?qū)Π椎鞍椎耐ㄍ感訹4-6]。陳朝紅等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，部分FSGS患者血清可誘導(dǎo)足細胞骨架損傷、破壞足細胞間緊密連接，并可導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生蛋白尿。盡管人們在不停的探尋循環(huán)因子，但其本質(zhì)仍不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，組織或細胞來源的microRNAs(miRNAs)可在血清、血漿等體液中穩(wěn)定存在，不僅如此，循環(huán)miRNA可隨血循環(huán)到達遠隔器官和組織，繼而影響其功能，是一種新的細胞-細胞之間相互作用的方式[8，9]。Zhang等[8]認為組織或細胞來源的miRNA可包裹在分泌性微囊泡(MV)中，隨著MV分泌到循環(huán)中，進入靶細胞作為內(nèi)源性miRANs調(diào)節(jié)多種靶基因或者信號事件。如Mittelbrunn等[10]研究發(fā)現(xiàn)免疫細胞間存在抗原依賴的exosome介導(dǎo)的單向的miRNAs轉(zhuǎn)移，這種miRNAs的轉(zhuǎn)移可加強免疫細胞間的信號傳遞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中基因的表達。又如Cantaluppi等[11]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞來源的MV能通過miRNA依賴的腎臟細胞的重編程保護腎臟免于缺血再灌注損傷。

循環(huán)miRNAs能否作為一種循環(huán)因子參與FSGS的發(fā)病呢?本研究通過TaqMan低密度芯片及實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)，尋找出與FSGS活動相關(guān)的循環(huán)miRNAs，為下一步揭示循環(huán)因子本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

對象和方法

病例選擇入選標(biāo)準(zhǔn)：性別不限，年齡18～60歲，腎活檢明確診斷為特發(fā)性FSGS。采樣時患者臨床表現(xiàn)為活動[即尿蛋白定量≥3.5 g/24h，血清白蛋白(Alb)≤30 g/L]或非活動(即尿蛋白定量<0.4 g/24h，Alb>35 g/L)。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性FSGS、合并惡性腫瘤、糖尿病、難以控制的高血壓、近半年內(nèi)出現(xiàn)心肌梗塞、心力衰竭、腦出血等嚴(yán)重心腦血管并發(fā)癥、既往1月內(nèi)出現(xiàn)感染者(如肺部感染，局部軟組織炎，反復(fù)上呼吸道感染)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶或谷草轉(zhuǎn)氨酶>正常值的2倍、明確的乙型肝炎或其他病毒感染血清學(xué)指標(biāo)陽性者、妊娠、哺乳期女性。同時選取年齡、性別匹配的正常志愿者作為正常對照。所有患者均簽署書面知情同意書。

臨床資料收集所有入組患者，收集記錄以下臨床數(shù)據(jù)：年齡、性別、24h尿蛋白定量、Alb、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)和總膽固醇。

血漿標(biāo)本的留取對所有入選者，使用EDTA抗凝管留取血液標(biāo)本，室溫靜置1h后，于室溫3 000g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移入除酶的Eppendoff管后于4℃10 000g離心5 min，將上層血漿轉(zhuǎn)移入新的除酶的Eppendoff管中-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血漿總RNA提取對于送檢TaqMan低密度芯片的標(biāo)本，選取性別、年齡匹配的活動性FSGS患者及正常對照各9例，每組每例取等量血漿混合后使用Trizol(Invitrogen)法提取總RNA，即每份血漿中加入兩倍體積的Trizol，然后進行2次酚/氯仿抽提，得到的RNA用20 μl DEPC水溶解后送Invitrogen公司行miRNA低密度芯片檢測[12]。對于進行qRT-PCR驗證的標(biāo)本，每例取100 μl血漿，用酚/氯仿去除蛋白，異丙醇沉淀RNA，20 μl DEPC水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆肹13]。

血漿miRNA低密度芯片檢測將提取的血漿總RNA送Invitrogen公司行TaqMan低密度芯片檢測。芯片版本為TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0，采用7900HT PCR 系統(tǒng)進行檢測(Applied biosystems)。通過分析擴增曲線，得到所檢測miRNAs的循環(huán)閾值(threshold cycle，CT)，以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT計算各miRNAs的變化倍數(shù)，選取CT值<30且活動性FSGS循環(huán)miRNAs較正常對照升高>2倍的miRNAs進行后續(xù)的驗證。

差異表達miRNAs的驗證差異表達miRNAs的驗證采用qRT-PCR方法。10 μl逆轉(zhuǎn)錄體系包括：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(Takara)2 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara)0.5 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)1 μl，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物(Applied Biosystems)1 μl，RNA 2 μl，DEPC水3.5 μl。反應(yīng)條件為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。所得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?0 μl定量PCR體系包括：10×PCR緩沖液(Takara)2 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)0.4 μl，MgCl2(Takara，25 mmol/L)1.2 μl，Taq酶(Takara)0.3 μl，TaqMan探針(Applied Biosystems)0.33 μl，水14.77 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，然后95℃ 15s，60℃ 1 min進行40個循環(huán)。所有的PCR反應(yīng)均行3副孔。

統(tǒng)計學(xué)分析利用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。以miRNA-16繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每例標(biāo)本中miRNA的絕對表達量(fmol/L)。采用Mann-Whitney U檢驗比較不同組之間循環(huán)miRNAs表達水平的差異。采用受試者操作特性曲線(ROC curve)及ROC曲線下面積(AUC)評估循環(huán)miRNAs區(qū)分活動性FSGS與非活動性FSGS及正常對照的價值。采用Spearman相關(guān)性分析分析循環(huán)miRNAs表達量與各臨床指標(biāo)間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床資料本研究選取9例活動性FSGS用于TaqMan低密度芯片分析。其中男性6例，女性3例，平均28.44歲。9例正常對照的年齡、性別與活動性FSGS患者匹配。后續(xù)qRT-PCR驗證選取活動性FSGS患者32例，年齡、性別匹配的正常對照30例。同時我們還檢測了15例非活動性FSGS患者血漿中候選miRNAs的水平，三組基本臨床資料見表1。

表1 循環(huán)miRNAs水平驗證病例的臨床資料

FSGS患者循環(huán)miRNAs低密度芯片檢測結(jié)果及差異miRNAs篩選該芯片總共檢測754個miRNAs，本研究中共檢出242個miRNAs，檢出率為32%。另有68%的miRNAs由于在血漿中含量較低，未能檢出，表明現(xiàn)有芯片的檢測靈敏度對于一些豐度較低的miRNAs的篩選有待提高。以miRNAs變化倍數(shù)>2倍且CT值<30作為篩選條件，在活動性FSGS患者血漿中上調(diào)的miRNAs有45個，下調(diào)的miRNAs有119個。選取上調(diào)的miRNAs進行獨立樣本驗證。

FSGS患者循環(huán)中表達上調(diào)的miRNAs的獨立樣本驗證為了驗證TaqMan低密度芯片結(jié)果，我們采用qRT-PCR的方法在獨立樣本中對活動性FSGS患者循環(huán)中表達上調(diào)的miRNAs進行了驗證。表達上調(diào)的miRNAs定義為：CT值<30、上升倍數(shù)>2倍、兩組比較P<0.05。獨立樣本包括32例活動性FSGS和30例正常對照。兩組的年齡、性別無差異，與正常對照組相比，活動性FSGS循環(huán)miRNA-125b、miRNA-186及miRNA-193a-3p表達上調(diào)(表2，圖1)。為了尋找與FSGS活動性相關(guān)的miRNAs，我們進一步檢測了非活動性FSGS患者循環(huán)中這3種miRNAs的水平。結(jié)果顯示，與正常對照相比，非活動性FSGS患者循環(huán)中僅miRNA-125b和miRNA-193a-3p升高，而miRNA-186無明顯變化(表2，圖1)。與非活動性FSGS相比，活動性FSGS患者循環(huán)miRNA-186表達則明顯上調(diào)(表2，圖1)。

表2 循環(huán)中表達上調(diào)miRNAs含量的比較

圖1 三組患者循環(huán)miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p濃度

循環(huán)miRNAs含量與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析活動性FSGS患者循環(huán)中上述3種miRNAs的表達量較正常對照明顯升高，我們進一步探討了循環(huán)中這3種miRNAs的濃度與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性，僅發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA-125b水平與BUN水平顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.406，P=0.021)。循環(huán)中上述3種miRNAs水平，與患者年齡、性別、尿蛋白定量、Alb、SCr、總膽固醇水平均無相關(guān)性。

循環(huán)miRNAs水平與FSGS疾病活動的關(guān)系我們采用ROC曲線分析了循環(huán)miRNAs區(qū)分活動性FSGS與正常對照的能力。結(jié)果顯示上述3種miRNAs對于區(qū)分活動性FSGS與正常對照均具有較高價值,AUC分別為0.882(95%CI：0.802～0.963)、0.789(95%CI：0.674～0.903)和0.910(95%CI：0.84～0.981)。以5.706 fmol/L為界值時，miRNA-125b的最優(yōu)敏感度和特異度分別為81.3%和80%；以38.352 fmol/L為界值時，miRNA-186的最優(yōu)敏感度和特異度分別為62.5%和90%；以8.011 fmol/L為界值時，miRNA-193a-3p的最優(yōu)敏感度和特異度分別為78.1%和93.3%(圖2A～C)。這三者中miRNA-193a-3p具有最高的特異度，而miRNA-125b具有最好的敏感度。

通過qRT-PCR驗證后發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNA-186水平在活動性FSGS和非活動性FSGS患者間存在顯著差異，于是我們采用ROC曲線分析了循環(huán)miRNA-186對FSGS疾病活動判斷的價值(圖2D)。結(jié)果顯示循環(huán)miRNA-186對FSGS活動與否具有較高的判斷價值，AUC為0.848(95%CI：0.736～0.960)。以31.16fmol/L為界值時，miRNA-186區(qū)分FSGS活動與非活動的最優(yōu)敏感度和特異度分別為75%和93.3%。

圖2 A～C：FSGS-A組循環(huán)miRNAs與正常對照組ROC曲線的比較；D：FSGS-A組與FSGS-NA組ROC曲線的比較

討 論

目前，F(xiàn)SGS的發(fā)病機制尚未完全闡明。臨床實踐發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎移植術(shù)后數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)原發(fā)病即可復(fù)發(fā)[1]，復(fù)發(fā)的FSGS進行血漿置換或免疫吸附可有效減少蛋白尿[2，3，14]?；加蠪SGS的母親娩出的新生兒可出現(xiàn)短暫的蛋白尿[15]。研究發(fā)現(xiàn)部分FSGS患者血漿不僅可以增加腎小球?qū)Π椎鞍椎耐ㄍ感?，而且注射大鼠后可誘發(fā)蛋白尿[4-6]。陳朝紅等[7]也發(fā)現(xiàn)部分FSGS患者血清可導(dǎo)致足細胞骨架蛋白F-actin和足細胞間緊密連接蛋白ZO-1的破壞，而這部分陽性血清注射大鼠可導(dǎo)致大鼠足細胞足突融合和蛋白尿的產(chǎn)生。這些重要的臨床現(xiàn)象及研究結(jié)果均提示FSGS患者蛋白尿的發(fā)生與循環(huán)因子有關(guān)，為人們研究循環(huán)因子在FSGS發(fā)病中的作用提供了依據(jù)。

自從1972年Hoyer等[1]學(xué)者首次提出循環(huán)因子概念，大量研究提示特發(fā)性FSGS中可能有循環(huán)因子的存在。研究認為循環(huán)因子為30～50 kD的糖蛋白，包含疏水基團，對蛋白A、半乳糖具有高親和性，在70%～80%飽和硫酸銨溶液中具有最高的活性，對熱及蛋白酶敏感，可被血漿置換清除[4，6，16]。有研究認為心肌營養(yǎng)素樣因子(CLC-1)可能作為一種循環(huán)因子引起腎臟損傷[17]。CLC-1是白細胞介素6(IL-6)家族成員，分子量約30 kD，可經(jīng)半乳糖親和層析法富集，存在于活動性FSGS患者血漿中，能引起Palb增加，降低腎小球中nephrin的表達，而CLC-1抗體則可以阻斷FSGS患者血清引起Palb的增加。Wei等[18]等則在復(fù)發(fā)性FSGS患者血漿中檢出可溶性尿激酶受體(suPAR)，他們發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性FSGS患者移植前血漿中suPAR升高。suPAR通過活化足細胞整合素β3引起足突融合及蛋白尿。但是糖尿病、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病時suPAR也是升高的[19，20]，suPAR與循環(huán)因子的關(guān)系及suPAR的來源目前都不清楚。盡管人們在不停的探尋循環(huán)因子，但其本質(zhì)及作用機制仍不清楚。

近年研究認為循環(huán)miRNAs是一種新的細胞-細胞之間交流的方式。如EB病毒感染的細胞分泌的含有病毒miRNAs的exosome能進入未感染的受體細胞，抑制CXCL11的表達[21]。在免疫細胞之間，同樣存在著這種交流方式，如Mittelbrunn等[10]研究發(fā)現(xiàn)T細胞分泌的miRNAs(如miRNA-335)可以在exosome的介導(dǎo)下單向轉(zhuǎn)移到抗原遞呈細胞(APC)中，并顯著下調(diào)APC中其靶基因SOX4的表達。這種miRNAs的轉(zhuǎn)移可加強免疫細胞間的信號傳遞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中基因的表達。還有研究發(fā)現(xiàn)單核巨噬細胞(THP-1)分泌的miRNA-150能以MV的形式進入人微血管內(nèi)皮細胞株(HMEC-1)細胞，使后者miRNA-150表達水平明顯升高，c-Myb蛋白的表達明顯下降，從而增強HMEC-1細胞的遷移能力，體內(nèi)研究則發(fā)現(xiàn)THP-1分泌的miRNA-150能進入血管內(nèi)皮細胞，增加血管內(nèi)皮細胞中miRNA-150的表達水平[8]。間充質(zhì)干細胞分泌的MVs能促進腎小管上皮細胞的增生，使其免于凋亡，并且能促進丙三醇誘導(dǎo)的SCID小鼠急性腎損傷(AKI)的形態(tài)和功能恢復(fù)[22]。這些結(jié)果表明病理狀態(tài)下MV中攜帶的分泌性miRNAs可到達受體細胞和遠隔組織發(fā)揮功能。

基于以上幾點，我們試圖探討FSGS患者T細胞分泌的循環(huán)miRNAs能否作為一種循環(huán)因子，引起足細胞損傷及蛋白尿。而本研究則通過TaqMan低密度芯片及qRT-PCR方法系統(tǒng)分析了FSGS患者循環(huán)miRNAs表達譜，尋找出與FSGS活動性相關(guān)的循環(huán)miRNAs，為探討這一問題奠定了基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)活動性FSGS患者循環(huán)miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p含量較正常對照明顯升高，表明這3種miRNAs表達水平可能與活動性FSGS相關(guān)。ROC曲線分析表明循環(huán)miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p均能較好的區(qū)分活動性FSGS與正常對照。但由于樣本量較小，我們并未發(fā)現(xiàn)這些miRNAs含量與尿蛋白、Alb等臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。為了進一步探討這3種循環(huán)miRNAs與FSGS活動性的關(guān)系，我們檢測了非活動性FSGS患者循環(huán)中這3種miRNAs的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)與非活動性FSGS相比，活動性FSGS患者循環(huán)miRNA-186水平顯著升高，而miRNA-125b和miRNA-193a-3p水平則無明顯變化。而ROC曲線分析也顯示循環(huán)miRNA-186能較好的區(qū)分活動性FSGS與非活動性FSGS。這些結(jié)果表明循環(huán)miRNA-186水平與FSGS活動性關(guān)系更為密切。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA-125b參與調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)通路從而控制多種器官的分化[23]；慢性腎臟病(CKD)3～4期的患者，血清miRNA-125b、miRNA-145和miRNA-155表達下調(diào)，CKD大鼠胸主動脈及原代血管平滑肌細胞中miRNA-125b的表達也是下調(diào)的，在CKD患者血管重塑異常中可能發(fā)揮了一定作用[24]。 miRNA-186的作用廣泛，在多種疾病中都被發(fā)現(xiàn)表達異常，在不同疾病中其作用也不一樣。急性心肌梗死患者血清miRNA-186水平較正常對照顯著升高，與其他五種升高的miRNAs(miRNA-1、miRNA-134、miRNA-208、miRNA-223和miRNA-499)一起，可作為診斷急性心肌梗死的生物標(biāo)志物[25]。在非小細胞肺癌(NSCLC)中miRNA-186通過抑制PTTG1的表達而抑制NSCLC的轉(zhuǎn)移[26]，而沉默miRNA-186后促進NSCLC細胞的增生，在NSCLC組織中miRNA-186的表達下調(diào)，且miRNA-186表達低與患者生存率低相關(guān)[27]。而在子宮內(nèi)膜癌細胞中，miRNA-186可通過抑制抑癌基因FOXO1的表達而使細胞周期調(diào)節(jié)異常、細胞凋亡異常[28]。miRNA-193a-3p通過抑制其靶基因Mcl-1，誘導(dǎo)U251和HeLa細胞的凋亡、ROS堆積及DNA損傷[29]。結(jié)直腸癌患者癌組織及血中miRNA-193a-3p、miRNA-23a和miRNA-338-5p表達上調(diào)，且其表達水平隨腫瘤進展而升高，可能作為結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物[30]。但是，miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p在FSGS中的作用尚不清楚，今后我們會在本研究的基礎(chǔ)上深入探討這一問題。

小結(jié)：本研究發(fā)現(xiàn)活動性FSGS患者循環(huán)miRNA-125b、miRNA-186和miRNA-193a-3p表達高于正常對照，且活動性FSGS患者循環(huán)miRNA-186高于非活動性FSGS患者，表明循環(huán)miRNAs與FSGS患者活動性密切相關(guān)。本文結(jié)果提示循環(huán)miRNAs不僅可能作為判斷FSGS疾病活動的生物標(biāo)志物，且可能在FSGS發(fā)病中起到重要作用。

1 Hoyer JR,Vernier RL,Najarian JS,et al.Recurrence of idiopathic nephrotic syndrome after renal transplantation.Lancet,1972,2(7773):343-348.

3 Artero ML,Sharma R,Savin VJ,et al.Plasmapheresis reduces proteinuria and serum capacity to injure glomeruli in patients with recurrent focal glomerulosclerosis.Am J Kidney Dis,1994,23(4):574-581.

4 Savin V J,Sharma R,Sharma M,et al.Circulating factor associated with increased glomerular permeability to albumin in recurrent focal segmental glomerulosclerosis.N Engl J Med,1996,334(14):878-883.

5 Sharma M,Sharma R,Reddy SR,et al.Proteinuria after injection of human focal segmental glomerulosclerosis factor.Transplantation,2002,73(3):366-372.

6 Sharma M,Sharma R,McCarthy ET,et al."The FSGS factor：" enrichment and in vivo effect of activity from focal segmental glomerulosclerosis plasma.J Am Soc Nephrol,1999,10(3):552-561.

7 陳朝紅,劉志紅,秦衛(wèi)松,等.利用體外培養(yǎng)足細胞針對局灶節(jié)段性腎小球硬化患者的循環(huán)因子進行檢測.腎臟病與透析腎移植雜志,2009,18(1):3-12.

8 Zhang Y,Liu D,Chen X,et al.Secreted Monocytic miRNA-150 Enhances Targeted Endothelial Cell Migration.Mol Cell,2010,39(1):133-144.

9 Chen X,Liang H,Zhang J,et al.Secreted microRNAs:a new form of intercellular communication.Trends Cell Biol,2012,22(3):125-132.

10 Mittelbrunn M,Gutiérrez-Vázquez C,Villarroya-Beltri C,et al.Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.Nat Commun,2011,2：282.

11 Cantaluppi V,Gatti S,Medica D,et al.Microvesicles derived from endothelial progenitor cells protect the kidney from ischemia-reperfusion injury by microRNA-dependent reprogramming of resident renal cells.Kidney Int,2012,82(4):412-427.

12 Zhang C,Wang C,Chen X,et al.Expression profile of microRNAs in serum:a fingerprint for esophageal squamous cell carcinoma.Clin Chem,2010,56(12):1871-1879.

13 Liu R,Chen X,Du Y,et al.Serum microRNA expression profile as a biomarker in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer.Clin Chem,2012,58(3):610-618.

14 Haas M,Godfrin Y,Oberbauer R,et al.Plasma immunadsorption treatment in patients with primary focal and segmental glomerulosclerosis.Nephrol Dial Transplant,1998,13(8):2013-2016.

15 Kemper MJ,Wolf G,Müller-Wiefel DE.Transmission of glomerular permeability factor from a mother to her child.N Engl J Med,2001,344(5):386-387.

16 Savin VJ,McCarthy ET,Sharma R,et al.Galactose binds to focal segmental glomerulosclerosis permeability factor and inhibits its activity.Transl Res,2008,151(6):288-292.

17 McCarthy ET,Sharma M,Savin VJ.Circulating Permeability factors in idiopathic nephrotic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis.Clin J Am Soc Nephrol,2010,5(11):2115-2121.

18 Wei C,El Hindi S,Li J,et al.Circulating urokinase receptor as a cause of focal segmental glomerulosclerosis.Nat Med,2011,17(8):952-960.

19 Eugen-Olsen J,Andersen O,Linneberg A,et al.Circulating soluble urokinase plasminogen activator receptor predicts cancer,cardiovascular disease,diabetes and mortality in the general population.J Intern Med,2010,268(3):296-308.

20 Sehestedt T,Lyngbk S,Eugen-Olsen J,et al.Soluble urokinase plasminogen activator receptor is associated with subclinical organ damage and cardiovascular events.Atherosclerosis,2011,216(1):237-243.

21 Pegtel DM,Cosmopoulos K,Thorley-Lawson DA,et al.Functional delivery of viral miRNAs via exosomes.Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(14):6328-6333.

22 Bruno S,Grange C,Deregibus MC,et al.Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.J Am Soc Nephrol,2009,20(5):1053-1067.

23 Kim SW,Ramasamy K,Bouamar H,et al.MicroRNAs miRNA-125a and miRNA-125b constitutively activate the NF-kappaB pathway by targeting the tumor necrosis factor alpha-induced protein 3(TNFAIP3,A20).Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(20):7865-7870.

24 Chen NX,Kiattisunthorn K,O'Neill KD,et al.Decreased MicroRNA Is Involved in the Vascular Remodeling Abnormalities in Chronic Kidney Disease(CKD).PLoS One,2013,8(5):e64558.

25 Li C,Fang Z,Jiang T,et al.Serum microRNAs profile from genome-wide serves as a fingerprint for diagnosis of acute myocardial infarction and angina pectoris.BMC Med Genomics,2013,6：16.

26 Li H,Yin C,Zhang B,et al.PTTG1 promotes migration and invasion of human non-small cell lung cancer cells and is modulated by miRNA-186.Carcinogenesis,2013[Epub ahead print].

27 Cai J,Wu J,Zhang H,et al.miRNA-186 downregulation correlates with poor survival in lung adenocarcinoma,where it interferes with cell-cycle regulation.Cancer Res,2013,73(2):756-766.

28 Myatt SS,Wang J,Monteiro LJ,et al.Definition of microRNAs that repress expression of the tumor suppressor gene FOXO1 in endometrial cancer.Cancer Res,2010,70(1):367-377.

29 Kwon JE,Kim BY,Kwak SY，et al.Ionizing radiation-inducible microRNA miRNA-193a-3p induces apoptosis by directly targeting Mcl-1.Apoptosis,2013,18(7):896-909.

30 Yong FL,Law CW,Wang CW.Potentiality of a triple microRNA classifier:miRNA-193a-3p,miRNA-23a and miRNA-338-5p for early detection of colorectal cancer.BMC Cancer,2013,13：280.