連續(xù)性靜脈-靜脈血液透析濾過(CVVHDF)能通過削弱血液循環(huán)中炎癥介質(zhì)的峰值濃度,重建機體免疫系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài),防治多器官功能障礙綜合征(MODS)。內(nèi)毒素是炎癥反應(yīng)的啟動物質(zhì)，是最早發(fā)揮作用的前炎癥細胞因子，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[1,2]。CD14是在宿主抗病原微生物免疫應(yīng)答中起重要作用的內(nèi)毒素相關(guān)受體分子,是內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的始動環(huán)節(jié)[3,4]。高遷移率族蛋白1(HMGB 1)是膿毒癥晚期致死性的促炎介質(zhì)，受內(nèi)毒素等刺激可分泌至細胞外，作為炎癥介質(zhì)參與MODS病理生理過程[5,6]。內(nèi)毒素通過內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合CD14啟動Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的促炎反應(yīng)，產(chǎn)生更多的細胞因子及炎癥介質(zhì)[7]。HMGB 1具有增強內(nèi)毒素與LBP的結(jié)合效應(yīng)，維持并延長炎癥反應(yīng)。HMGB 1的促炎功能和動力學(xué)特點加劇了器官功能的損傷，共同導(dǎo)致MODS的發(fā)生發(fā)展[8]。因此，本文觀察CVVHDF治療MODS犬過程中血漿內(nèi)毒素、CD14、HMGB 1及器官組織CD14、HMGB 1蛋白變化，探討其免疫調(diào)節(jié)機制。

方 法

模型制作與分組18只雄性Beagle犬,體重15±2 kg(由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。隨機分為正常對照組(n=6)、MODS組(n=6)和CVVHDF組(n=6)。

MODS模型建立：(1)動物稱重，固定，消毒，術(shù)前1h戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈麻醉。經(jīng)口氣管插管，管深26 cm，插管成功后接呼吸機輔助呼吸，模式為容量控制通氣(CMV)，參數(shù)：潮氣量12 ml/kg、呼吸頻率為15次/min、吸氧濃度0.30。行右頸內(nèi)靜脈和左股動脈穿刺術(shù)，置入5F Swan-Ganz漂浮導(dǎo)管和20 G動脈留置針，連接心功能監(jiān)護儀行血流動力學(xué)監(jiān)測。(2)失血性休克和復(fù)蘇:術(shù)后20 min,采用Wiggers法[9]造成失血性休克,維持平均動脈壓(MAP)6.0～7.3 kPa 1h。休克終點,經(jīng)頸靜脈快速回輸失血和兩倍失血量的林格氏液?；剌斖戤匨AP和心排指數(shù)(CI)均能恢復(fù)至傷前水平的80%以上。(3)復(fù)蘇12h后由靜脈持續(xù)12h滴入內(nèi)毒素(大腸桿菌O111B4內(nèi)毒素,第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部微生物學(xué)教研室提供)1.5 mg/kg。

MODS造模成功的標(biāo)志:動物致傷24h后出現(xiàn)≥2個器官衰竭者診斷為MODS,24h內(nèi)發(fā)生器官衰竭或死亡者,視為復(fù)蘇失敗。呼吸功能障礙標(biāo)準(zhǔn):PaO2<8 kPa(60 mmHg); 肝功能功能障礙標(biāo)準(zhǔn):谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)>2倍對照值; 腎功能障礙標(biāo)準(zhǔn):少尿,血清尿素氮>2倍對照值;胃腸道功能障礙標(biāo)準(zhǔn):黏膜出血、糜爛、應(yīng)激性潰瘍形成。出現(xiàn)2個或2個以上器官功能障礙者即可診斷為MODS[10]。

MODS組未行CVVHDF治療，CVVHDF組在內(nèi)毒素注射完畢后(T3)即動物模型建模完成時行CVVHDF治療24h。兩組動物均對癥支持治療：24h補液量：100 ml/kg,總量約1 500 ml/24h。以50%葡萄糖注100 ml～200 ml/24h 補充能量，總熱量(kcal)=1.25×30×體重+70。分別于術(shù)前(T1)、內(nèi)毒素注射前(T2)、內(nèi)毒素注射完畢后0h(T3)、3h(T4)、6h(T5)、9h(T6)、12h(T7)、18h(T8)及24h(T9)，留取血標(biāo)本待測。

CVVHDF方法均采用右側(cè)頸內(nèi)靜脈或股靜脈留置單針雙腔導(dǎo)管建立血管通路,采用PRISMA-flex型智能化床旁腎臟替代治療機(瑞典)，AN-69型濾器(膜面積0.9 m2)，血流量150 ml/min,透析液1 L/h,置換液1L/h,前稀釋法輸入。治療時間為24h。肝素首劑1 kU/kg，此后以2 kU/4h靜脈泵入。超濾量根據(jù)全天治療量和生理需要量設(shè)定。

檢測指標(biāo)內(nèi)毒素定量測定采用MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)、EKT-5M Set 內(nèi)毒素檢測試劑盒(購自北京金山船科技發(fā)展公司)。CD14及HMGB 1測定采用ELISA法，按試劑盒說明進行(購自美國R&D公司)。

Western Blot法檢測各臟器組織CD14、HMGB 1蛋白表達處死后(T9)立刻剖腹取肺臟、心臟、肝臟、腎臟及開顱取腦組織，取100 mg組織置于冰皿上,加入200 μl裂解液,Brandforad法測定蛋白濃度。每組各取50 μg樣品進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜。脫脂奶TBS-T溶液封閉1h，隨后加入一抗CD14 1∶1 000 (Thermo scientific,Pierce Biotechnology,MAI-82693)，HMGB 1 1∶2 000 (ab12029,Hong Kong),β-actin 1∶1 000 (sc-47778,Santa Cruz Biotechnoogy,USA) 4℃ 孵育過夜，次日洗膜后與HRP標(biāo)記的二抗孵育2h，洗膜。使用ECL試劑盒顯色曝光成像。采用Fuji Image軟件分析，目的蛋白/β-actin比值作為目的蛋白相對表達量。

病理學(xué)檢查處死后(T9)立刻剖腹取肺臟、心臟、肝臟、腎臟及開顱取腦組織，觀察臟器大體形態(tài)后，切取組織，經(jīng)體積分數(shù)為10%的甲醛固定，常規(guī)石蠟制片，HE染色。

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 12.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析,不同指標(biāo)各時間點兩組比較采用成組t檢驗，如方差不齊則采用兩樣本的t＇檢驗。治療前后采用重復(fù)測量資料方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

血漿內(nèi)毒素、CD14及HMGB 1變化MODS組輸入內(nèi)毒素后血漿內(nèi)毒素、CD14及HMGB 1水平呈進行性升高并保持在較高水平,分別在T7、T9、T8時間點達高峰約為試驗前的12.5、3.3、5.8倍。CVVHDF組，經(jīng)CVVHDF治療后內(nèi)毒素、CD14及HMGB 1水平均逐漸下降，在T6～9時間點顯著低于MODS組(P<0.01)(表1，圖1～3)。

表1 兩組血漿內(nèi)毒素、CD14及HMGB 1變化

圖1 CVVHDF 組和MODS組血漿內(nèi)毒素變化

圖2 CVVHDF 組和MODS組血漿CD14變化

圖3 CVVHDF 組和MODS組血漿HMGB 1變化

各臟器組織CD14、HMGB 1蛋白表達變化在正常狀態(tài)下，肺臟、心臟、肝臟、腎臟及腦組織CD14、HMGB 1蛋白表達水平較低。經(jīng)兩次打擊后，MODS組肺臟、心臟、肝臟、腎臟及腦組織CD14、HMGB 1蛋白表達均較正常對照水平明顯升高(P<0.01)。經(jīng)CVVHDF治療后，CVVHDF組各組織中CD14、HMGB 1蛋白表達均有所降低，其中，CVVHDF組肝臟及腦組織CD14蛋白表達顯著低于MODS組(P<0.05)，CVVHDF組肺臟、腎臟及腦組織HMGB 1蛋白表達顯著低于MODS組(P<0.05)(表2、3)。

表2 三組各臟器組織CD14蛋白表達變化

表3 三組各臟器組織HMGB 1蛋白表達變化

各臟器組織病理學(xué)改變

肺臟 正常肺組織可見肺泡、肺泡壁、肺泡腔及支氣管、血管。MODS組動物肺泡擴張，肺泡間隔變窄并斷裂，相鄰肺泡融合成較大的囊腔。肺泡上皮脫落，毛細血管擴張充血，肺泡腔出血。CVVHDF組損害減輕，部分肺泡壁斷裂，肺泡融合。肺泡腔內(nèi)出血，并見心衰細胞。

心臟 正常心肌組織心肌細胞及細胞核結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，間質(zhì)動靜脈分布正常。MODS組心肌結(jié)構(gòu)紊亂，心肌細胞肥大，部分心肌細胞脂肪變性，閏盤減少，血管擴張充血，間質(zhì)出血。CVVHDF組損害減輕心肌細胞腫脹，細胞密度增高，部分胞質(zhì)內(nèi)呈嗜酸性顆粒樣變，間質(zhì)少許炎細胞。

肝臟 正常肝臟組織肝細胞結(jié)構(gòu)規(guī)則，少許肝細胞脂肪變性。MODS組正常肝板結(jié)構(gòu)消失，結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞萎縮脂肪變性，點灶狀壞死，肝竇擴張淤血出血，匯管區(qū)小膽管增生，炎細胞浸潤。CVVHDF組損害減輕，中央靜脈擴張，肝細胞水腫，胞質(zhì)疏松淡然，氣球樣變性，肝小葉與匯管區(qū)輕度炎細胞浸潤。

腎臟 正常腎臟組織腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)排列正常。MODS組腎小球細胞數(shù)量增多，部分球囊壁增厚，腎小管腫脹，間質(zhì)出血，炎細胞浸潤。CVVHDF組損害減輕，腎小球及間質(zhì)毛細血管擴張充血，腎小管細胞胞質(zhì)淡染，水腫。

腦組織 正常腦組織可見排列正常的少突膠質(zhì)細胞和星形細胞。MODS組腦組織呈海綿狀，細胞內(nèi)和細胞間質(zhì)明顯水腫腫脹，腦血管擴張充血，腦血管間隙增寬。CVVHDF組損害減輕，腦組織略呈海綿狀，神經(jīng)細胞輕度腫脹。

討 論

隨著對MODS發(fā)病機制的深入研究，免疫功能改變、免疫動態(tài)平衡失調(diào)在MODS發(fā)病中的作用逐漸受到重視。連續(xù)性血液凈化治療MODS的免疫調(diào)節(jié)機制[11-14]：(1)有效清除循環(huán)中可溶性炎性介質(zhì)，減輕炎癥介質(zhì)對免疫細胞功能直接抑制; 阻斷Th1向Th2的漂移; 減輕淋巴細胞異常凋亡。(2)清除血中除炎癥介質(zhì)以外其他毒性物質(zhì)及致病因子。(3)抑制炎癥系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)相互作用，阻斷炎癥級聯(lián)。(4)改善組織氧合和心肺功能，重建機體免疫系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)狀態(tài)等。本研究觀察CVVHDF治療MODS犬過程中血漿LPS、CD14、HMGB 1及器官組織CD14、HMGB 1蛋白變化，探討其免疫調(diào)理機制。

本研究采用失血性休克+復(fù)蘇灌注+內(nèi)毒素血癥建立MODS模型[15]，主要依據(jù)：(1)臨床MODS多為復(fù)合因素所致，創(chuàng)傷性休克及感染最為多見；(2)創(chuàng)傷性休克患者常并發(fā)感染，且多在傷后數(shù)小時發(fā)生；(3)細菌感染最終是細菌釋放內(nèi)毒素起作用。故本模型先造成失血性創(chuàng)傷，使機體免疫系統(tǒng)處于激活狀態(tài)，再注入內(nèi)毒素，成為二次打擊的觸發(fā)因子，模擬人類膿毒血癥時內(nèi)毒素釋放入血的特點。

本模型優(yōu)點：(1)實驗動物常用小鼠、大鼠、家兔等,與人類種屬差異較大的小動物實驗資料很難解釋很多臨床現(xiàn)象。哺乳類動物犬在生理上與人類較接近,對休克創(chuàng)傷有更強的耐受力。因此,Beagle犬是建立MODS模型比較理想的動物。(2)造模方法上不同以往MODS動物造模方法,提高內(nèi)毒素靜脈注射劑量,將短時足量注射改為緩慢持續(xù)靜脈滴注,使動物機體有充分反應(yīng)時間,造模成功率為80%(其中3只實驗動物犬分別因室顫、失血性休克、麻醉意外死亡)。(3)建立了動物ICU,予全程呼吸和循環(huán)器官支持及監(jiān)護,全面真實反映MODS的發(fā)病因素、臨床特征及發(fā)生發(fā)展過程。

Ronco等[14]研究證實，CVVHDF治療MODS犬能明顯改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)的低血壓，提高動脈血氧分壓，有效清除血漿內(nèi)毒素，改善腎功能。本研究結(jié)果顯示，在MODS病程中，機體血漿內(nèi)毒素、CD14及HMGB 1水平呈進行性升高并保持在較高水平,肺臟、心臟、肝臟、腎臟及腦組織CD14、HMGB 1蛋白表達顯著升高，肺臟、心臟、肝臟、腎臟及腦組織病理損傷較嚴重；CVVHDF治療后，通過有效清除可降低循環(huán)中內(nèi)毒素、CD14及HMGB 1水平，各組織中CD14、HMGB 1蛋白表達均有所降低，其中，CVVHDF組肝臟及腦組織CD14蛋白表達顯著低于MODS組(P<0.05)，CVVHDF組肺臟、腎臟及腦組織HMGB 1蛋白表達顯著低于MODS組(P<0.05)。肺臟、心臟、肝臟、腎臟及腦組織病理損傷明顯減輕。Hagiwara等[16]研究發(fā)現(xiàn),血漿內(nèi)毒素、CD14、HMGB 1及器官組織CD14、HMGB 1蛋白表達水平與膿毒癥嚴重程度及疾病進展密切相關(guān)。本試驗CVVHDF治療組，血漿內(nèi)毒素、CD14、HMGB 1及各組織中CD14、HMGB 1蛋白表達明顯低于MODS組，說明CVVHDF治療通過血液濾過可削弱血循環(huán)中大多數(shù)炎癥介質(zhì)的峰值濃度，下調(diào)各組織中CD14、HMGB 1蛋白表達，重建機體免疫系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在一定程度上改善病情。

綜上所述，過度的炎癥反應(yīng)是MODS發(fā)生的本質(zhì)原因之一，CVVHDF能夠削弱血循環(huán)中內(nèi)毒素、CD14及HMGB 1等炎癥介質(zhì)的峰值濃度，下調(diào)肺臟、心臟、肝臟、腎臟及腦組織中CD14、HMGB 1蛋白表達，有效遏制過度的炎癥反應(yīng)，從而防治MODS。

1 張振宇,艾克拜爾.亞力坤,楊小朋,等.高容量血液濾過對多器官功能障礙犬內(nèi)毒素及CD14的影響.中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2011,20(9):930-934.

2 Volman TJ,Goris RJ,van der Meer JW,et al.Tissue- and time-dependent upregulation of cytokine mRNA in a murine model for the multiple organ dysfunction syndrome.Ann Surg,2004,240(1):142-150.

3 郭洪志,屈傳強,賈建平.急性前腦缺血致多器官功能障礙綜合征動物模型的建立及內(nèi)毒素受體CD14的表達.中國腦血管病雜志,2004,1(2):85-90.

4 Calvano JE,Agnese DM,Um JY,et al.Modulation of the lipopolysaccharide receptor Complex(CD14,TLR4,MD-2) and toll-like receptor 2 in systemic inflammatory response syndrome-positive patients with and without infection:relationship to tolerance.Shock,2003,20(5):415-419.

5 Lotze MT,Tracey KJ.High-mobility group box 1 protein (HMGB 1):nuclear weapon in the immune arsenal.Nat Rev Immunol,2005,5(4):331-342.

6 Liu H,Yao YM,Yu Y,et al.Role of Janus kinase/signal transducer and activator of transcription pathway in regulation of expression and inflammation-promoting activity of high mobility group box protein 1 in rat peritoneal macrophages.Shock,2007,27(1):55-60.

7 Verbon A,Dekkers PE,ten Hove T,et al.IC14,an anti-CD14 antibodies inhibits endotoxin-mediated symptoms and inflammatory response in humans.J Immunol,2001,166(5):3599-3605.

8 康華,姜虹.高遷移率族蛋白B1與膿毒癥關(guān)系的研究進展.醫(yī)學(xué)綜述,2009,15(16):2410-2413.

9 胡森,盛志勇,周寶桐,等.雙相遲發(fā)多器官功能不全綜合癥(MODS)動物模型的研究.中華創(chuàng)傷雜志,1996,12(2):102-106.

10 方國恩,華積德,沈炎明,等.一種新的動物多器官衰竭模型的建立.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,1995,16(1):86-88

11 陶曉根,劉寶,王錦權(quán).連續(xù)性血液凈化的免疫調(diào)節(jié)作用與膿毒癥.中國急救醫(yī)學(xué)，2007,27(11):1039-1041.

12 Hotchkiss RS,Karl IE.The pathophysiology and treatment of sepsis.N Engl J Med,2003,348(2):138-150.

13 Ronco C,Brendolan A,Lonnemann G,et al.A pilot study of coupled plasma filtration with adsorption in septic shock.Crit Care Med,2002,30(6):1250-1255.

14 Ronco C,Bonello M,Bordoni V,et al.Extracorporeal therapies in non-renal disease:treatment of sepsis and the peak concentration hypothesis.Blood Purif,2004,22(1):164-174.

15 陳繼紅，張振宇，李玉芳，等.兩次打擊致犬多器官功能衰竭的實驗研究.中華急診雜志,2010,19(11):1167-1170.

16 Hagiwara S,Iwasaka H,Togo K,et al.A neutrophil elastase inhibitor,sivelestat,reduces lung injury following endotoxin-induced shock in rats by inhibiting HMGB 1.Inflammation,2008,31(4):227-234.