林立忠 李劍鋒

[摘要] 目的 研究丹參酮ⅡA對人肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制作用及誘導(dǎo)其凋亡的作用，探討丹參酮ⅡA抑制腫瘤的作用機(jī)制。 方法 將丹參酮ⅡA配制成0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的濃度，0 μg/L為陰性對照。將肝細(xì)胞在不同濃度的丹參酮ⅡA中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，采用MTT法檢測丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期和凋亡情況。 結(jié)果 相同的濃度，隨著時(shí)間延長，吸光度逐漸下降，而同一時(shí)間，隨著濃度的增加，吸光度也逐漸下降。相同濃度，隨著時(shí)間的延長，丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制率逐漸增加，相同時(shí)間，隨著濃度的增加，丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制率也逐漸增加。隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，G0/G1的比例逐漸升高（2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL），與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2的生長具有抑制作用，且具有時(shí)間和濃度依賴性，對凋亡的誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。

[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；肝癌細(xì)胞；HepG2；凋亡

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）08-0004-03

惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人們的健康和生命。隨著環(huán)境的惡化、人們工作生活壓力的增加，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升。惡性腫瘤的發(fā)病與細(xì)胞的增殖和凋亡異常有密切關(guān)系。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率較高，僅次于胃癌[1]。臨床上的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療，但每種治療方法都有較大的不良反應(yīng)。近年來生物療法逐漸引起臨床醫(yī)生的重視，其具有副作用小、療效高、避免正常細(xì)胞免受損傷的優(yōu)勢。丹參酮ⅡA可以增強(qiáng)細(xì)胞Caspase-3的活性，抑制細(xì)胞的癌基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。目前國外有關(guān)丹參對肝癌HepG2細(xì)胞有抑制作用的報(bào)道屢見不鮮，但關(guān)于丹參酮ⅡA對肝癌HepG2細(xì)胞的作用的報(bào)道還比較少。本文主要是研究丹參酮ⅡA對肝癌HepG2細(xì)胞生長的抑制作用以及對其凋亡的誘導(dǎo)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞株HepG2購自上海博谷生物科技有限公司。丹參酮ⅡA由西安鴻生生物技術(shù)有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) （1）肝癌細(xì)胞HepG2復(fù)蘇，將細(xì)胞置入30℃～40℃水浴中迅速溶解，移至培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液到5 mL。培養(yǎng)條件37℃，5%CO2濕度飽和。每48 h換液一次，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。（2）細(xì)胞傳代：取出細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次。加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細(xì)胞，30 s后加血清的DMEM培養(yǎng)液，分裝其他培養(yǎng)瓶，并補(bǔ)充培養(yǎng)液。（3）將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。取出培養(yǎng)好的細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細(xì)胞，30 s后加細(xì)胞凍存液，分裝至凍存管。4℃凍存10 min，-20℃凍存30 min，-70℃保存。

1.2.2 藥物處理 無水乙醇溶解丹參酮ⅡA，配成2.0 mg/mL備用。將含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，共分為5個(gè)濃度：0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL；0 μg/mL為對照組。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1 不同濃度丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制 將對數(shù)生長期的肝細(xì)胞HepG2 PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，濃度為1×105個(gè)/mL。將單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔接種100 μL，培養(yǎng)24 h后換含藥的培養(yǎng)液。空白組為不含細(xì)胞只含培養(yǎng)液；陰性對照組為含0 μg/mL丹參酮ⅡA；實(shí)驗(yàn)組為5個(gè)不同濃度丹參酮ⅡA。每組共重復(fù)8孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。然后棄去培養(yǎng)液，加入20 μL新鮮MTT液，培養(yǎng)4 h候棄去培養(yǎng)液。每孔加入120 μL DMSO，震蕩至結(jié)晶完全溶解，使用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取吸光度值（A），共重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值）×100%。

1.3.2檢測細(xì)胞周期和凋亡情況 收集不同濃度丹參酮ⅡA處理過的細(xì)胞1×105個(gè)，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，緩慢加入70%乙醇1mL，4℃下保存過夜。取出后離心去除固定液，PBS緩沖液洗滌3次，加1.0 mg/mL的RnaseA 200 μL，37℃下水浴30 min，加PI 800 μL染色液，避光，4℃保存30 min，進(jìn)行檢測。采用流式細(xì)胞儀（美國BD流式細(xì)胞儀）進(jìn)行檢測，采用分析軟件計(jì)算凋亡率和各凋亡周期的比例。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制作用

相同的濃度，隨著時(shí)間延長吸光度逐漸下降，而同一時(shí)間，隨著濃度的增加吸光度也逐漸下降。見表1。相同濃度，隨著時(shí)間的延長，丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制率逐漸增加；相同時(shí)間，隨著濃度的增加，丹參酮ⅡA對肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制率也逐漸增加。見圖1、2。

2.2細(xì)胞周期分布和凋亡率

搜集丹參酮ⅡA作用72 h的細(xì)胞，觀察細(xì)胞周期，可見隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，G0/G1的比例逐漸升高（2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL），與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。隨著丹參酮ⅡA濃度（0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL）的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。熒光顯微鏡下的細(xì)胞凋亡形態(tài)見圖3、4。

3 討論

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，目前針對肝癌的治療方法較多，涉及到多個(gè)學(xué)科的共同協(xié)作，如能得到正確合理的治療，肝癌遠(yuǎn)期療效還是比較理想的。目前臨床上的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等。手術(shù)治療對患者本身也是一種創(chuàng)傷，而化療和放療均對患者有較大的副作用。因此，了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找效果好、副作用小的治療方法成為臨床的熱點(diǎn)。目前生物療法，包括免疫療法等逐漸在臨床上廣泛應(yīng)用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的異常增殖和凋亡有關(guān)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，它并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中十分必要。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35、CrmA、IAPs、FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。

丹參酮ⅡA為唇形科植物丹參（salvia miltiorrhza）中分離的二萜醌類化合物，臨床應(yīng)用廣泛[3-6]，能夠改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)，抑制血栓疾病發(fā)生，具有顯著擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、降低心肌耗氧量、減慢心率和增加心肌收縮力的作用。丹參素及丹參酮IIA均能顯著延長小鼠耐缺氧時(shí)間，減輕缺氧引起的心肌損傷，同時(shí)，改善心肌收縮力，促進(jìn)心肌再生，具有抗氧化作用，可防止LDL的氧化，從而保護(hù)EC，維持其分泌PGL2的正常功能，抗AS形成。研究報(bào)道，丹參酮對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。吳俊偉[7]研究丹參酮ⅡA抑制人食管癌細(xì)胞的生長及機(jī)制，結(jié)果顯示其對Eca-1-9細(xì)胞的增殖具有抑制作用，丹參酮ⅡA濃度在1 μg/mL及以上濃度抑制作用明顯，并隨著濃度升高抑制作用增強(qiáng)。不同濃度的丹參酮ⅡA處理過Eca-1-9細(xì)胞后，抑制細(xì)胞凋亡的基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯下降。鐘志宏等[8]研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性。熒光染色可以觀察典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征，瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的凋亡細(xì)胞形成的梯狀條帶，作用72 h后，隨著濃度的增加細(xì)胞的凋亡率也逐漸增加。江城鋒等[9]研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA及其衍生物對Hela細(xì)胞的增殖具有抑制作用，對丹參酮ⅡA進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，能夠增強(qiáng)其抑制作用。

MTT全稱為3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，主要用于細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。1983年由Mosmann等[10]首先報(bào)道用MTT比色法測定細(xì)胞活性劑抗癌藥物對細(xì)胞增殖、活性效應(yīng)。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能[11]。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。本文采用MTT方法檢測丹參酮ⅡA對肝細(xì)胞癌HepG2的生長抑制作用。結(jié)果顯示，相同濃度隨著時(shí)間的延長，吸光度逐漸下降，而相同時(shí)間，隨著濃度的升高吸光度也逐漸下降。說明丹參酮ⅡA對肝細(xì)胞癌HepG2的生長抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性。0.5 μg/mL的濃度對細(xì)胞生長的抑制作用不明顯。對作用72 h的細(xì)胞檢測不同細(xì)胞周期所占比例，發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸增加。G0期是細(xì)胞休眠期，而G1期是從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期，又稱合成前期。G0/G1期細(xì)胞的上升，S期細(xì)胞的下降提示丹參酮ⅡA抑制細(xì)胞生長的同時(shí)，也在誘導(dǎo)細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。對凋亡率的檢測顯示，隨著濃度的升高，細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，說明丹參酮ⅡA能有誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌HepG2的凋亡，并且具有濃度依賴效應(yīng)。

綜上所述，丹參酮ⅡA作為中藥的提取物，在臨床的應(yīng)用廣泛。其對肝癌細(xì)胞HepG2的生長具有抑制作用，并且具有時(shí)間和濃度依賴性，對凋亡的誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。

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（收稿日期：2013-01-18）