扶東　凡杭　史曉露　劉艷菊

摘要：運(yùn)用熒光光譜法探究藥物與血清白蛋白相互作用已成為藥物基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容，本文就熒光光譜法的研究方法和內(nèi)容作一綜述，并討論了本研究的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：藥物 血清白蛋白 熒光光譜

中圖分類號(hào)：R96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2013）14-0054-02

藥物大多通過(guò)與生物體內(nèi)大分子的相互作用而展現(xiàn)生物活性。血清白蛋白作為血漿中最重要的蛋白質(zhì)，擔(dān)負(fù)著儲(chǔ)存和運(yùn)輸藥物及其它內(nèi)源性和外源性小分子的任務(wù)，因此常作為靶點(diǎn)與藥物結(jié)合。熒光光譜法因其自身強(qiáng)選擇性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為研究藥物與生物大分子相互作用的重要手段[1]。本文主要對(duì)藥物與血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究方法、作用機(jī)制、結(jié)合特征等方面進(jìn)行綜述。

1 熒光光譜研究方法[2，3]

1.1 熒光猝滅法

熒光猝滅是指熒光體（如蛋白質(zhì)分子）與溶質(zhì)分子（如相關(guān)藥物小分子）結(jié)合作用，引起熒光體熒光強(qiáng)度降低或不發(fā)生熒光的現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)研究猝滅過(guò)程的光譜研究，可得到藥物與蛋白質(zhì)相互作用的相關(guān)參數(shù)信息。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸是血清白蛋白分子中含有能夠發(fā)射熒光的氨基酸殘基，其中，色氨酸熒光在蛋白質(zhì)固有熒光中占有重要地位，選擇295nm為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，則基本只發(fā)射色氨酸熒光。因此，色氨酸的熒光變化對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化及藥物分子的作用對(duì)其構(gòu)象的影響都能提供相應(yīng)的參考。

1.2 同步熒光光譜法

同步熒光譜法是在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選一適宜的波長(zhǎng)差值Δλ，用發(fā)射和激發(fā)兩個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，由測(cè)得的相關(guān)數(shù)據(jù)，通過(guò)軟件繪制成同步熒光光譜圖。同步熒光與激發(fā)和發(fā)射光譜都有關(guān)，根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的吸收和發(fā)射性能改善選擇性。同步熒光光譜法分為固定波長(zhǎng)同步掃描熒光光譜法、固定能量同步掃描熒光光譜及可變波長(zhǎng)的同步熒光光譜，在研究藥物與血清白蛋白的相互作用時(shí)應(yīng)用最多的是固定波長(zhǎng)同步掃描熒光光譜法。固定波長(zhǎng)同步掃描熒光光譜法是在掃描過(guò)程中使激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)間保持固定的差值，通常情況下選擇等于斯托克斯位移的Δλ。當(dāng)固定Δλ=60nm和Δλ=15nm時(shí)的同步熒光光譜為色氨酸殘基和酪氨酸殘基的特征熒光光譜。溶液環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象有很大影響，故蛋白質(zhì)構(gòu)象變化依據(jù)繪制的同步熒光光譜圖的改變來(lái)判斷分析。

2 熒光光譜研究?jī)?nèi)容[4，5]

2.1 研究熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅的原因通常是由于熒光物質(zhì)與猝滅劑作用引起熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低、熒光量子效率降低或激發(fā)態(tài)壽命縮短。一般情況下，藥物加入蛋白質(zhì)溶液中使蛋白質(zhì)固有的熒光下降的猝滅機(jī)制主要有靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅和非能量輻射。靜態(tài)猝滅是由藥物與蛋白質(zhì)基態(tài)分子生成不發(fā)熒光光的配合物或分子復(fù)合物。動(dòng)態(tài)猝滅與溫度有關(guān)，是藥物與蛋白質(zhì)基態(tài)相互作用的結(jié)果。動(dòng)態(tài)猝滅作用過(guò)程符合Stern-Volmer方程：

F0/F=1+KQτ0[Q]=1+Ks[Q]

F0，F(xiàn)分別是蛋白質(zhì)與藥物作用前后Q的熒光強(qiáng)度，KQ為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，τ0為生物大分子的平均壽命，一般約為1×10-8s，[Q]為猝滅劑Q的濃度，Ks為Stern-Volmer常數(shù)，以此方程作圖，可以得到一條截距為1、斜率為Ks的直線。

文獻(xiàn)表明，靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅的判斷依據(jù)如下：

（1）依據(jù)猝滅常數(shù)相關(guān)變化。

對(duì)于動(dòng)態(tài)淬滅，溫度升高增大動(dòng)態(tài)淬滅的熒光猝滅效率，增大猝滅常數(shù)。而靜態(tài)淬滅常形成分子復(fù)合物，溫度升高可能導(dǎo)致復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，從而熒光強(qiáng)度下降。另?yè)?jù)研究發(fā)現(xiàn)，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1，倘若求得的KQ大于此常數(shù)，則可判定為靜態(tài)猝滅，此為科研實(shí)驗(yàn)中最常用的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

（2）測(cè)定熒光分子的熒光壽命。

當(dāng)發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)，猝滅劑使熒光分子壽命縮短，τ0=F0/F；當(dāng)發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí)，猝滅劑并不改變熒光分子激發(fā)態(tài)的壽命，τ0=1。測(cè)定熒光分子的熒光壽命是區(qū)分動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅最確切的手段。

2.2 確定結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以通過(guò)雙對(duì)數(shù)公式求出，當(dāng)熒光分子與猝滅劑相互結(jié)合作用時(shí)，其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)Ka可由下式求出。

Lg[（F0-F）/F]=nLg[Q]+LgKa

做Lg[（F0-F）/F]對(duì)Lg[Q]的圖，根據(jù)斜率和截距求得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)Ka。

2.3 確定作用力常見(jiàn)類型

藥物與血清白蛋白質(zhì)間的作用力，通常包括氫鍵（HydrogenBond）、范德華力（Vander walls force）、靜電引力（Electrostatic interactions）和疏水力（Hydrophobic interactions）。藥物不同，與蛋白質(zhì)的作用力類型也不同，常根據(jù)測(cè)得的熱力學(xué)參數(shù)來(lái)推測(cè)作用力的類型。而在實(shí)際情況下，由于蛋白質(zhì)特殊的空間結(jié)構(gòu)，它和藥物分子之間的作用力類型往往不是單純的一種，常會(huì)出現(xiàn)幾種作用力同時(shí)存在的情況。利用Vant Hoff方程可計(jì)算出反應(yīng)的焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，由此可以求出自由能變?chǔ)，然后根據(jù)這些熱力學(xué)參數(shù)的相對(duì)大小，來(lái)綜合判斷分析藥物與蛋白質(zhì)間的主要作用力類型。

Ln（K2/K1）=（1/T1-1/T2）ΔH/R

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)得出函數(shù)關(guān)系為：當(dāng)ΔH<0，ΔS<0主要表現(xiàn)為范德華力或氫鍵；ΔH>0，ΔS>0主要表現(xiàn)為疏水作用力；ΔH<0，ΔS>0主要表現(xiàn)為靜電作用力。

3 展望

藥物分子與血清白蛋白的研究與應(yīng)用涉及醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)藥學(xué)、病理學(xué)、化學(xué)、生命科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域，該方面研究已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著藥代動(dòng)力學(xué)（PK）、藥效動(dòng)力學(xué)（PD）及臨床藥理學(xué)的快速發(fā)展，藥物-蛋白質(zhì)結(jié)合對(duì)PK-PD影響作用具有重要的實(shí)際意義。

為提供更多更有效的相關(guān)參數(shù)信息，應(yīng)根據(jù)三維熒光光譜圖，拓建指紋熒光圖譜，開(kāi)展更深入更系統(tǒng)化的研究，如蛋白質(zhì)與藥物相互作用部位結(jié)構(gòu)特征的進(jìn)一步考察、藥物-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合強(qiáng)度和結(jié)合時(shí)間等。探索熒光分析新方法，注重與其他研究方法緊密結(jié)合將推動(dòng)未來(lái)研究的深入，嘗試開(kāi)辟細(xì)胞整體水平上研究的新途徑，全面綜合闡明藥物與血清白蛋白作用機(jī)制及化學(xué)本質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

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