范文娟

【摘要】效液相色譜法檢測下限為3mg/mL的硒具有高選擇性、高效率、高靈敏度和操作簡單、快速等優(yōu)點，國外應(yīng)用較多。國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗上因儀器昂貴、試劑消耗大，推廣較慢。原子熒光分析法檢出極限lmg/mL，線性范圍為2.5～500ng/mL。它有一定的局限性，但在亞洲特別是中國和日本使用廣泛。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；原子熒光分析法；硒

一、原子熒光分析法測定魚中硒的含量

測定魚硒含量的方法有幾種：原子熒光分析法、微分極譜法、氣相色譜和高效液相色譜法、中子活化分析法、化學(xué)發(fā)光淬滅法等。本文采用原子熒光分析和高效液相色譜法對魚硒含量進(jìn)行測定并比較。

（一）材料與方法

1、儀器與試劑

儀器：AFS-230雙道原子熒光光度計；硒高強(qiáng)度空心陰極燈；

試劑：鹽酸、硝酸、高氯酸均為國產(chǎn)GR級試劑，硼氫化鉀、氫氧化鉀為國產(chǎn)AR級試劑。

2、儀器條件選擇

光電倍增管負(fù)高壓：320V；硒空心陰極燈電流：80Ma；原子化器溫度：9000C；

爐高：8mm；載氣流量900mL/min；屏蔽氣流量1100mL/min；

測量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；讀數(shù)時間：12s；進(jìn)樣體積：1mL

3、樣品的獲取與前處理

取草魚的頭部皮膚，中間魚肉，尾巴和肝臟組織于60度左右的烘箱中烘干并碾成粉末狀。

準(zhǔn)確稱取草魚樣品粉末0.2g，置于50mL小燒杯中，加入體積比為4：1的硝酸與高氯酸，室溫放置過夜，加熱消化。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶敛橛邪嘴F時，再加熱至剩余體積約1mL。冷卻，加入6mol/LHCl5mL，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)橥该鳠o色并伴有大量白霧出現(xiàn)。冷卻，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用10%HCl定容到10.00 mL。再準(zhǔn)確稱取0.1g草魚粉末樣品，同上述方法操作，最終定容到5.00mL。

4、實驗方法

采用原子熒光法，將順序注射儀的進(jìn)樣管放入盛有樣品的容量瓶中，設(shè)定儀器進(jìn)樣量為1.0mL，以10%HC1為載流溶液，同體積進(jìn)樣，并與樣品混合，進(jìn)入反應(yīng)器與還原劑硼氫化鉀混合，以氬氣為載氣，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定樣品硒含量。儀器工作條件如下：光電倍增管負(fù)高壓320V；原子化器高度8 mm；空心陰極燈燈電流80mA；載氣流量900mL/min；屏蔽氣流量1100mL/min；載流液10%HC1；進(jìn)樣體積1.0mL。硒標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為10ng/mL，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，采用10%的HC1，儀器自動逐級稀釋為1、2、4、6、8和10ng/mL系列溶液，測定不同濃度硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量。所有魚樣品硒含量均平行測定3次（n=3），取平均值。

5、硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制硒標(biāo)準(zhǔn)系列0.004、0.012、0.020、0.040、0.120、0.200mg/L，根據(jù)實驗優(yōu)化條件進(jìn)行魚硒的測定，硒濃度在此范圍與熒光強(qiáng)度呈線性正向關(guān)系，R=0.9997，曲線回歸方程y=51.298+23294.412x，x為硒濃度，y為熒光強(qiáng)度。

結(jié)果見表2-1。

表2-1 標(biāo)準(zhǔn)硒系列的測定結(jié)果

圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

（二）結(jié)果

通過對草魚樣品的測定，平行測定三次得出三個熒光強(qiáng)度為771.51、769.79、801.56，得出平行三次測定的硒濃度為0.0353、0.0357、0.0366mg/kg。取其平均值為0.0359mg/kg。

（三）測定條件的選擇原因

負(fù)高壓和燈電流是影響測定靈敏度的主要因素，熒光強(qiáng)度隨負(fù)高壓或燈電流的增大而增加，但負(fù)高壓、高電流會縮短燈的壽命，使儀器噪聲增大，對測定不利，因此采用較高的負(fù)高壓（320V）和燈電流（80mA），以獲得較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和良好的信噪比。測定的靈敏度隨爐高的增加而減少但爐高太低時，散射光將造成很高的背景讀數(shù)，令空白值增大，本實驗結(jié)果顯示爐高8mm較合適。

二、高效液相色譜法測定魚中痕量硒含量

（一）儀器與試劑

高效液相色譜儀，附帶熒光檢測器；

數(shù)據(jù)處理機(jī)硬件為Epson計算機(jī)，軟件為Perkin—Elmer公司產(chǎn)品。

硒標(biāo)準(zhǔn)濃液：取l000μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)貯存液（GSBG62029—90）1.0mL于100mL容量瓶中，以0.1mol/L HCL稀釋至刻度作為標(biāo)準(zhǔn)中間液，硒含量為10μg/mL。再以0.1mol/L HCL稀釋得硒含量為0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

0.1 % 2，3-二氨基萘溶液：稱取100mg2-3-二氨基萘于250mL磨口三角瓶中，加入l00mL 0.1mol/L鹽酸，振搖至全部溶解后，加入20mL環(huán)己烷繼續(xù)振播5min，移入分液漏斗，靜置分層后將水相放回原三角瓶內(nèi)，再用環(huán)已烷淬取幾拔，直至環(huán)己烷相無色為止，將此純化的水溶液貯于棕色瓶中，加一層約lcm厚的環(huán)己烷隔絕空氣，置冰箱內(nèi)保存。

EDTA混和液：量取50mL 0.2mol/L EDTA、50mL 1.0 mol/L 鹽酸羥胺及5mL 0.02 mol/L 甲酚紅指示液.加水稀釋至1L混勻。

（二）實驗方法

1、樣品處理

稱取1.0g均勻魚樣于50mL試管中，加入6mL濃HNO3浸泡過夜，次日沸水浴消化至無色或淡黃色透明。再加入2.0mL飽和草酸銨溶液，沸水浴加熱60min，消除HNO3和NO-2對測定的影響，試管中溶液即為樣品消化液。

2、熒光物的生成

于上述樣品消化液中加入10mLEDTA混和液，用1 ： 1氨水及10% HCI調(diào)至粉紅色（pH 1.5～2.0），加入2.0mL 0.1 % DAN水溶液，振勻，沸水浴加熱5min后冷卻，反應(yīng)生成的4，5-苯并苤硒（NSD）用2mL環(huán)己烷振搖萃取2min，于暗處放置l0min，取l0μL環(huán)己烷相進(jìn)液相色譜儀。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確取0.5ug/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.6、1.0、1.4、2.0mL（分別相當(dāng)于0、0.1、0.3，0.5、0.7、1.0μg），加水至5mL，按樣品消化液測定步驟同時進(jìn)行測定，結(jié)果Se含量在0～1.0μg范圍內(nèi)。峰高與含量有良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=41.28x+0.4497 R=0.9923。

4、硒的回收率

表3-1 測定硒的回收率

5、 結(jié)果與討論

用本法測定魚中的痕量硒平行實驗三次得出結(jié)果分別為：0.0297、0.0312、0.0361mg/kg。

取其平均值0.0299mg/kg。

（1）流動相的選擇

反相液相色譜通常選用甲醇—水或乙腈—水體系為流動相。實驗證明。4，5-苯并苤硒腦在乙腈—水體系中的熒光強(qiáng)度比在甲醇—水體系中的熒光強(qiáng)度強(qiáng)，100%乙腈中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，且峰分離最好，靈敏度最高。所以本法選用l00%乙腈為流動相。

（2）發(fā)射波長的選擇

用一定量硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的消化處理液多次注入液相色譜儀，分別選用不同波長進(jìn)行實驗，波長在558nm處有最大吸收。

三、結(jié)論

高效液相色譜法檢測下限為3mg/mL的硒具有高選擇性、高效率、高靈敏度和操作簡單、快速等優(yōu)點，國外應(yīng)用較多?，F(xiàn)今雖然在國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗上因儀器昂貴、試劑消耗大，使其方法推廣較慢。

原子熒光分析法檢出極限lmg/mL，線性范圍為2.5～500ng/mL。它有一定的局限范圍，在中國和日本用到的比較多。

因此，原子熒光分析法在現(xiàn)今的社會應(yīng)用廣泛。