劉曉娟，蔡?hào)|，王志偉，王浩

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

基于膠體制劑的滲透保留效應(yīng)的被動(dòng)靶向是提高藥物治療指數(shù)的一種重要方法，這樣的膠體粒子表面是親水的并且盡可能避免血漿中調(diào)理素的結(jié)合，一般用親水的高分子對(duì)粒子表面進(jìn)行覆蓋或修飾。聚乙二醇是最常見(jiàn)的一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的親水高分子，直接將其與疏水鏈段鍵合后形成膠束是形成親水修飾粒子較簡(jiǎn)單的方法之一［1－2］。

脂肪族聚酯是一類在藥劑學(xué)中非常重要的疏水高分子，其可作為微球、水凝膠、膠束、植入小棒、電紡纖維等多種藥物控制釋放系統(tǒng)［3］，現(xiàn)研究較多的為人工合成的α－羥基聚酯和ε－羥基聚酯［4］，此外還有β－羥基聚酯，γ－羥基聚酯等亦有所研究，但該兩者只能通過(guò)發(fā)酵方法制備很難控制聚合度重現(xiàn)性［5］。α－羥基脂肪酸可以通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合精確地控制分子量，但是現(xiàn)有的研究局限在分子中只有2、3 個(gè)碳原子的即聚乙醇酸，聚乳酸及其共聚物［6］，碳原子數(shù)較多的α－羥基聚酯的研究還較少，僅有數(shù)篇文獻(xiàn)報(bào)道［7－8］。本文合成聚乙二醇嵌段的聚α－羥基辛酸，親水與親脂部分嵌段比相等，可在水中形成膠束，并且試采用此高分子膠束包裹一系列常見(jiàn)的藥物，發(fā)現(xiàn)對(duì)蒿甲醚，α－亞麻酸兩者增溶效果好，且制備所得膠束在4 ℃，25℃和37 ℃條件下分別在4 d 和1 w 內(nèi)穩(wěn)定。

1 材料和儀器

3，6－二己基－1，4－二氧雜－2，5－二酮(辛交酯，純度＞98%，按文獻(xiàn)［9］合成)，聚乙二醇單甲氧基醚2000 (MePEG2000)， (Mw =2000，F(xiàn)luka 公 司，日 本);2－ 乙 基 己 酸 亞 錫 (Sn(OCt)2，Sigma 公司，純度＞95%，日本);甲苯(化學(xué)純，天津大茂化工有限公司);無(wú)水乙醇(分析純，天津大茂化工有限公司);丙酮(分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司)，三氯甲烷(分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司)，二氯甲烷(分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司)，正己烷(分析純，天津康科德化工有限公司)。蒿甲醚(上海DESANO公司，純度＞97%)，α－亞麻酸(按文獻(xiàn)［10］自制，純度＞98%)，吲哚美辛(寧波大紅鷹制藥，純度＞98%)，全反式維甲酸(山東良福制藥有限公司，純度＞98.5%)，布地奈德(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司，純度＞98%)，槲皮素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度＞97.5%)，紫杉醇(上海DESANO 公司，純度＞98%)。

核磁共振光譜儀 (1HNMR，Bruker，300 MHz，美國(guó))，凝膠滲透色譜(GPC，Wyatt Technology Inc.，DAWN HELEOS，Waters 泵，Shodex 804 凝膠柱，Optilab rEX 示差檢測(cè)器，美國(guó))，場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM－6301F，日本電子株式會(huì)社，分辨率1.5nm，加速電壓10 kV)，電熱套(ZDHW 型，河北黃驊中興儀器有限公司)，離心機(jī)(80－2 型，江蘇金壇中大儀器廠)，真空干燥箱(ZDF－6050 型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，旋片真空泵(ZXZ－2 型，浙江黃巖求精真空泵廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE－52ASHZ－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠)，去離子水(1810－B 型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器，江蘇金壇宏華儀器廠)，電冰箱(BCD－ 216YH 型，青島海爾股份有限公司)，高效液相色譜儀(包括UV－975 型紫外檢測(cè)器，PU－980 型泵，日本SHIMADZU 公司)，甲醇(色譜純，天津康科德化工有限公司)，乙腈(色譜純，天津康科德化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 聚乙二醇嵌段聚α－羥基辛酸的合成

圖1 聚乙二醇－b－聚α－羥基辛酸的開(kāi)環(huán)聚合法制備過(guò)程

并加以改進(jìn)［9］，無(wú)水氮?dú)夥諚l件下將5 g 用無(wú)水乙酸乙酯重結(jié)晶的辛交酯置于干燥反應(yīng)瓶中，110 ℃磁力攪拌20 min 揮干殘余的水分和有機(jī)溶劑，將5 g 的MePEG2000 和2 滴催化劑Sn(Oct)2溶解在100 mL 無(wú)水甲苯溶液中后注入辛交酯的反應(yīng)瓶中并連接分水器。在120 ℃磁力攪拌條件下，反應(yīng)物呈溶液狀態(tài)并進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，3 h 后停止加熱并旋蒸濃縮殘液至30 mL 左右，室溫下放冷后，將冷凍的1 ∶1 正己烷—乙醚混合液倒入并劇烈攪拌使聚合物析出。將此混合液在2000轉(zhuǎn)/min 條件下離心，棄去上清液將底部白色沉淀用冷的1 ∶1 正己烷—乙醚混合液再混懸，除去殘留的未反應(yīng)辛交酯，低聚合度產(chǎn)物和催化劑Sn(Oct)2，重復(fù)3 次后將底部白色沉淀在40 ℃真空抽干至恒重得純品PEG－PHO。

由圖2 和3 可知，得到了聚乙二醇嵌段的聚α－羥基辛酸，所得高分子的質(zhì)均分子量Mw，數(shù)均分子量Mn 和多分散系數(shù)PDI 由凝膠滲透色譜測(cè)定，以氯仿為流動(dòng)相。結(jié)果為Mw:4.96 × 103，Mn:4.73 ×103，PDI 為1.07。

圖2 聚合度約為15 的聚乙二醇嵌段聚α－羥基辛酸的1H 核磁共振光譜

2.2 干膜—水化法制備載藥膠束及藥物增溶結(jié)果

制備膠束的方法較多，將干膜水化法是速度最快的一種，可用于篩選藥物與成膠束材料的親和性［11］。具體將PEG－PHO 溶解于丙酮中，可得到澄清，均一，透明，微帶淡藍(lán)色乳光的溶液。所選擇的藥物均溶解于丙酮，藥物溶解于丙酮中。所選藥物均溶解在丙酮中。將藥物和PEG－PHO 溶解在丙酮中形成無(wú)色均一的溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下，40℃，10 min 左右，蒸除溶劑，所有樣品均在瓶壁上形成無(wú)色，均一，透明，無(wú)泡點(diǎn)的薄膜，在室溫下用純凈水水化，可以發(fā)現(xiàn)載有蒿甲醚，α－亞麻酸和吲哚美辛的膠束溶液均為澄清，均一，透明，微帶淡藍(lán)色乳光的溶液，全無(wú)無(wú)固體物質(zhì)析出。

圖4 中A 和B 是兩種載藥膠束的顯微形態(tài)及其粒徑大小及分布測(cè)量結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，載有蒿甲醚的PEG－PHO 膠束外觀圓整，粒徑較小，平均約在90 nm;載有蒿甲醚的PEG－PHO 膠束外觀亦較圓整，但是由于α－亞麻酸可能是油狀物，PEG－PHO 作為一種表面活性劑對(duì)其增溶時(shí)與其的結(jié)合，粒徑較前者，平均約在170 nm。

圖3 聚乙二醇－b－聚α－羥基辛酸的凝膠滲透色譜圖

表1 PEG－POH 膠束增溶效果較好的藥物

圖4 載藥膠束的形態(tài)表征

圖4C 給出了溶解蒿甲醚后的膠束溶液外觀，可以發(fā)現(xiàn)溶液澄清，無(wú)沉淀析出，微顯淡藍(lán)色乳光，說(shuō)明有膠體存在。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中亦采用干膜—水化法制備了載有其它藥物的膠束，比如紫杉醇、全反式維甲酸、槲皮素、布地奈德、吲哚美辛等。這些載藥薄膜在藥物:PEG－ PHO 為3 ∶100 時(shí)，在水化后即有大量的白色沉淀析出，可能是未被溶解的藥物或藥物與PEG－PHO 的混合物析出。很明顯在這種制備方法下，藥物不能夠被很好地包裹，原因可能為這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)不適合包裹。觀察PEG－PHO 的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，PHO部分相當(dāng)于把正己烷鍵合到聚酯鏈上，能夠很好增溶的2 個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)一個(gè)為醚萜類，一個(gè)為烷酸類，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似故相溶，實(shí)際上，紫杉醇、槲皮素等化合物在水中的溶解度很低，在正己烷這種非極性有機(jī)溶劑中的溶解度也低。這也證明了聚酯側(cè)鏈的化學(xué)基團(tuán)性質(zhì)對(duì)藥物增溶有影響。

全反式維甲酸，布地奈德，槲皮素，紫杉醇等均難溶于水，分子中含有較多的雜原子，全反式維甲酸雖然具有一個(gè)環(huán)狀烷基端且整個(gè)分子雜原子所占比例較少，但長(zhǎng)鏈部分為全反式的多共軛雙鍵結(jié)構(gòu)可能是影響其在膠束中增溶的原因之一;布地奈德整個(gè)分子雖為親脂性，但為4 個(gè)并聯(lián)環(huán)狀結(jié)構(gòu)能是影響其增溶的原因;槲皮素難溶于水，但在常見(jiàn)的有機(jī)溶劑中的溶解度尚可，分子中完全為芳香結(jié)構(gòu)，提示芳香結(jié)構(gòu)與n－己基側(cè)鏈的相容性很差，同樣的還有吲哚美辛可能也是由于分子中芳香結(jié)構(gòu)占主要比例所以增溶效果亦不佳，其在分子中的絕大部分是由5 個(gè)雙鍵和一個(gè)羰基形成的π－ π 結(jié)構(gòu)，所以在膠束內(nèi)核的包裹欠佳。藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)其溶解性的影響以及非離子型表面活性劑對(duì)藥物的增溶的影響因素復(fù)雜［12－13］，本文僅作直觀觀察和簡(jiǎn)單推測(cè)，具體原因還要通過(guò)其它方法進(jìn)一步闡釋和確證。

表2 PEG－POH 膠束增溶效果較差的藥物

這些化合物中，吲哚美辛可以以15 ∶100 的兩包裹在膠束中形成澄清溶液，但只能保持約30 min，隨后便逐漸析出大量的白色沉淀，取澄清狀態(tài)下的溶液迅速滴于載玻片上自然晾干后觀察可發(fā)現(xiàn)如圖5 中的結(jié)構(gòu)。

圖5 載有吲哚美辛的PEG－PHO 膠束

2.3 載蒿甲醚，α－亞麻酸和吲哚美辛膠束的含量穩(wěn)定性

理論上膠束為自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，但載藥膠束會(huì)受到被包載藥物的影響而產(chǎn)生合并，絮凝等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致體系中沉淀的出現(xiàn)。評(píng)價(jià)載藥膠束穩(wěn)定性的方法很多，其物理穩(wěn)定性可以通過(guò)評(píng)價(jià)其粒徑隨時(shí)間變化的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)［14］，但本法要求電子顯微鏡照片，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生的大樣本實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)費(fèi)時(shí)且成本極高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)載藥膠束溶液在一段時(shí)間后會(huì)析出沉淀，故采用評(píng)價(jià)上清液中未析出藥物的含量占原有載藥量百分比隨時(shí)間變化的方法來(lái)評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性，因?yàn)楹繙y(cè)定所需時(shí)間較短且成本較低。具體實(shí)驗(yàn)方法為將15 ∶100 載藥量的蒿甲醚，α－亞麻酸和吲哚美辛的膠束避光置于4 ℃，25℃和37 ℃的環(huán)境下，在不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察膠束溶液中是否有結(jié)晶或其它形態(tài)固體物質(zhì)析出，同時(shí)采用3000轉(zhuǎn)離心1 min 的方法將固體物質(zhì)離心后測(cè)定上清中液中藥物的含量，以其對(duì)時(shí)間作圖得圖6。

實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜－紫外分光光度法測(cè)定膠束中藥物含量，蒿甲醚流動(dòng)相為甲醇/水=90/10;α－亞麻酸的流動(dòng)相為乙腈/水=85/15;吲哚美辛的流動(dòng)相為:6 mmol 磷酸/乙腈=50/50。其中三者均采用Diamonsil C18柱，柱長(zhǎng)250 cm，填料粒徑5 μm，流動(dòng)相的流速均為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)均為210 nm，柱溫均為35 ℃，測(cè)定時(shí)采用相應(yīng)流動(dòng)相稀釋載藥膠束溶液。

圖6 不同溫度下，蒿甲醚(A)，α－亞麻酸(B)，吲哚美辛(C)PEG－PHO 膠束中的藥物含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化

對(duì)于蒿甲醚膠束，含量在4 d 之后開(kāi)始有明顯的下降，且體系中出現(xiàn)細(xì)小的結(jié)晶，該結(jié)晶在光線下能夠反光，2 w 后上清膠束中藥物含量小于初始含量的20%，容器底部含有較多結(jié)晶和白色絮狀物質(zhì);對(duì)于α－亞麻酸膠束，含量在7 d 之后開(kāi)始有明顯的下降，同時(shí)體系中有細(xì)小白色絮狀物質(zhì)出現(xiàn)，2 w 后上清膠束中藥物含量均在50%以下，容器底部含有較多白色絮狀物質(zhì);對(duì)于吲哚美辛膠束，30 min 后體系中既有大量白色細(xì)小碎片狀物質(zhì)析出，1 h 后上清中吲哚美辛含量為初始含量的60%多左右，2 h 后只剩下20%多的藥物包裹在膠束中，24 h 后各個(gè)溫度下上清液中含量均不到原有的5%。

綜上，可以發(fā)現(xiàn)α－亞麻酸膠束較之蒿甲醚膠束含量大幅下降起始時(shí)間延后4 d，且下降的速率慢，并且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束點(diǎn)，仍然留在上清膠束中的藥物保存量也多。蒿甲醚膠束在25 ℃和37 ℃儲(chǔ)存溫度時(shí)較4 ℃儲(chǔ)存溫度時(shí)含量穩(wěn)定，而α－亞麻酸膠束相反。蒿甲醚膠束和α－亞麻酸膠束的含量穩(wěn)定性能維持?jǐn)?shù)天而吲哚美辛膠束只能夠維持?jǐn)?shù)小時(shí)。這些現(xiàn)象是由藥物本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的，聚α－羥基辛酸相當(dāng)于把n－己烷連接在聚酯側(cè)鏈上，如果藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與n－己烷相容性差，則藥物很難增溶在聚α－羥基辛酸部位。蒿甲醚和β－欖香烯均為萜類化合物，前者分子中除氧原子外無(wú)雜原子，含有碳－碳鍵和醚鍵兩種親脂的化學(xué)鍵，后者分子中只含有碳－碳鍵并且無(wú)雜原子，是能夠溶解在n－己烷中的，而其它的化合物由于帶有雜環(huán)和環(huán)系，則在n－己烷中溶解度差而導(dǎo)致在聚α－羥基辛酸部位增溶效果差，小分子對(duì)藥物的溶解能力一定程度上決定其鍵合到高分子上后對(duì)藥物的溶解能力，這在以往的文獻(xiàn)中亦有所報(bào)道［15－16］。

3 討 論

3.1 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)可知除文獻(xiàn)報(bào)道的灰黃霉素外［8］417，PEG－PHO 所形成的膠束還對(duì)水難溶的蒿甲醚，α－亞麻酸有包載增溶作用，所形成的膠束分別為顆粒狀和液滴狀。盡管所形成的膠束僅能夠在數(shù)天內(nèi)穩(wěn)定，不能夠較長(zhǎng)期保存，但可以使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配，即水化能夠長(zhǎng)期保存的載藥干膜得到膠束溶液，故具有實(shí)用價(jià)值。

3.2 采用干膜—水化法制備載藥膠束時(shí)，該嵌段共聚物對(duì)全反式維甲酸，布地奈德，槲皮素，紫杉醇等的包裹能力較差。對(duì)吲哚美辛雖能包裹，但所得載藥膠束溶液在2 h 后內(nèi)析出將近80%的被載藥物，實(shí)用價(jià)值差。說(shuō)明膠束內(nèi)核化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)被載藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有要求。分子中無(wú)共軛體系的化合物能夠被較好包裹，當(dāng)然此結(jié)論還有待繼續(xù)實(shí)驗(yàn)加以充實(shí)。

3.3 本文采用的包裹藥物的方法為將嵌段共聚物/藥物/有機(jī)溶劑體系旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，值得注意的是這種方法可能并不是完好包裹藥物的一種較好方法，并且制備膠束不止干膜水化這一種方法，亦可以采用高分子/藥物混合有機(jī)溶液水透析法制備［10］202－204，而該方法下PEG－PHO 能否完好包裹本研究未被包裹的藥物需要進(jìn)一步的研究。

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