常珊珊，王 爽，吳 鋒，孟國梁，徐濟良

（南通大學醫(yī)學院藥理教研室，江蘇226001）

隨著人們生活水平提高和飲食結構的不斷改變，非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐年增高，現已成為我國常見的慢性肝病之一。目前認為NAFLD發(fā)病與胰島素抵抗、氧化應激、脂質過氧化及炎癥反應等因素密切相關[1]。近年來中藥在NAFLD治療中顯示良好的效果，靈芝多糖（Ganoderma Lucidum Polysaccharides，GLPs）是靈芝中最有效的成分之一。有學者對GLPs的降血糖、降血脂以及抗氧化作用做了一些有益的探索，但其對NAFLD療效的研究較少。本研究通過高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，觀察GLPs對血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、脂聯素的變化及對大鼠肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和環(huán)氧合酶-2（cycloxygenase-2，COX-2）表達的影響，探討GLPs對NAFLD的防治作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）動物：健康雄性成年SD大鼠72只，體重180～210 g，由南通大學實驗動物中心提供，使用許可證：FYXK（蘇）2007-0021。（2）主要試劑：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）測試盒（南京建成生物工程研究所）；脂聯素試劑盒（美國Linco公司）；TNF-α ELISA試劑盒（上海依科賽生物制品公司）；PPAR γ和COX-2多克隆抗體（巴敖得生物科技有限公司）；總RNA提取試劑盒（TIANGEN公司）；逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）試劑盒（美國MBI Fermentas公司）。（3）藥物：靈芝多糖，純度為75.61%（江蘇安惠生物科技有限公司，批號：080601），使用時用 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解；辛伐他汀，規(guī)格為10 mg/片（康普藥業(yè)股份有限公司，批號：090601），臨時用 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制1%的藥物濃度。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立：SD大鼠隨機分為6組，每組12只：正常組(N組)、模型組(M組)、靈芝多糖低劑量組(GLPs-L組)、中劑量組(GLPs-M組)、高劑量組(GLPs-H組)、辛伐他汀組(SV組)。N組喂食基礎飼料，其余各組大鼠給予高脂飼料:81.3%基礎飼料、10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶。造模同時，低、中、高劑量組每日以200 mg·kg-1、400 mg·kg-1、800 mg·kg-1靈芝多糖灌胃，辛伐他汀組以1.8 mg·kg-1辛伐他汀灌胃，連續(xù)給藥至第12周。

1.2.2 血清 ALT、AST、脂聯素和 TNF-α 含量的測定：第12周末，各組大鼠禁食不禁水12 h后，以20%烏拉坦0.5 mL/100 g體重腹腔注射麻醉，主動脈取血后3000r·min-1，15min后取血清備檢。ALT和AST含量按試劑盒說明用全自動生化分析儀檢測。脂聯素和TNF-α采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法,按照試劑盒說明進行檢測。

1.2.3 肝組織形態(tài)學觀察：取相同部位的肝臟以4%戊二醛溶液前固定，1%鋨酸溶液后固定，包埋液浸透、包埋，超薄切片機切片，常規(guī)染色后用透射電鏡觀察。

1.2.4 逆轉錄聚合酶鏈反應：采用RNA提取試劑盒，按照說明書方法從各組大鼠肝組織中提取總RNA，以oligo dT為逆轉錄引物逆轉錄合成cDNA。以逆轉錄合成的cDNA 1μL為模板進行PCR反應。大鼠PPAR γ、COX-2和GAPDH引物由上海生工生物科技有限公司合成。擴增條件：PPARγ：94°C預變性 3min，94°C 變性 30s，64°C 退火 75s，72°C 延伸1min，36 個循環(huán)。COX-2：95°C 預變性 4min，95°C 變性 1min，51°C 退火 30s，72°C 延伸 1min，40 個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收并純化目的基因。引物序列見表1。

表1 大鼠PPAR γ、COX-2和GAPDH引物合成基因序列

1.2.5 肝組織 PPAR γ 和 COX-2蛋白表達：采用蛋白質免疫印跡法(Western blot)，肝組織勻漿加入RIPA裂解液離心取蛋白上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。調整濃度后加樣電泳分離，再將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2h。一抗4°C孵育過夜，二抗室溫孵育2h后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描。一抗為1∶500兔抗大鼠PPAR γ和COX-2，內參一抗為1∶5 000兔抗大鼠GAPDH，二抗為1∶15 000 IRDye800標記的山羊抗兔IgG。PPAR γ和COX-2的表達水平，用目的蛋白條帶分別與GAPDH條帶灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析處理數據，計量資料用均數±標準差（xˉ±s）表示。多個樣本均數的比較用單因素方差分析，均數兩兩比較用q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GLPs對NAFLD 大鼠血清 ALT、AST、TNF-α 和脂聯素水平的影響 NAFLD模型組血清ALT、AST和TNF-α水平與正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。經給藥干預后靈芝多糖中劑量組、高劑量組和辛伐他汀組ALT和AST含量較模型組相比均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；靈芝多糖高劑量組和辛伐他汀組TNF-α含量較模型組相比也顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而靈芝多糖低劑量組與中劑量組TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。NAFLD模型組大鼠血清脂聯素的含量顯著降低（P＜0.01）；給藥后靈芝多糖低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而血清脂聯素含量，靈芝多糖中劑量組、高劑量組比辛伐他汀組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或 P＜0.01），見表 2。

表 2 各組大鼠血清 ALT、AST、TNF-α 和脂聯素水平（xˉ±s）

2.2 肝組織形態(tài)學透射電鏡觀察（1）正常組大鼠肝細胞結構正常，未見明顯變性；（2）NAFLD模型組大鼠肝細胞超微結構顯著改變，肝細胞內充滿大小不等的脂滴，染色體邊集和線粒體輕微腫脹等；（3）給予靈芝多糖12周后，低劑量組大鼠肝細胞超微結構未見明顯改善。中劑量組大鼠肝細胞超微結構稍有好轉，但多數細胞仍見部分脂滴。高劑量組和辛伐他汀組大鼠肝細胞中脂滴明顯減少，并且明顯縮小，線粒體腫脹和染色體邊集也明顯減輕，見圖1。

2.3 GLPs對NAFLD大鼠肝組織PPAR γ 和 COX-2 mRNA表達的影響 采用RT-PCR技術，檢測各組大鼠肝組織中PPAR γ和COX-2 mRNA的含量，以 PPAR γ mRNA、COX-2 mRNA 和 GAPDH mRNA含量的比值作為評價PPAR γ和COX-2 mRNA表達水平的指標。結果表明，NAFLD模型組大鼠PPAR γ mRNA表達水平較正常組相比顯著降低，COX-2 mRNA 表達則顯著升高（P＜0.01）。與 NAFLD模型組相比，靈芝多糖中劑量組、高劑量組和辛伐他汀組PPAR γ mRNA表達顯著上調，而COX-2 mRNA 表達則明顯下降（P＜0.05 或 P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義，見圖2。

2.4 GLPs對 NAFLD大鼠肝組織 PPAR γ 和COX-2蛋白表達的影響 Western Blot結果顯示，內參GAPDH皆均一表達。用圖像處理系統(tǒng)測得各組蛋白表達量和GAPDH的比值，NAFLD模型組PPAR γ的表達量顯著低于正常組（P＜0.05），靈芝多糖中劑量組、高劑量組和辛伐他汀組較NAFLD模型組均有所上調（P＜0.05 或 P＜0.01）。NAFLD 模型組 COX-2的表達量較正常組比較顯著升高（P＜0.01），靈芝多糖中劑量組、高劑量組和辛伐他汀組較NAFLD模型組均有所下降（P＜0.05 或 P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義，見圖 3、表 3。

圖1 各組大鼠肝組織超微結構（6000×）

圖3 各組大鼠肝組織PPAR γ和COX-2蛋白的表達A：N 組；B：M 組；C：GLPs-L 組；D：GLPs-M 組；E：GLPs-H 組；F：SV 組

表3 各組大鼠肝組織PPARγ和COX-2 蛋白相對表達量（xˉ±s，n=6）

圖2 各組大鼠肝組織PPAR γ和COX-2 mRNA的表達

3 討 論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種遺傳—環(huán)境—代謝應激相關性疾病。以彌漫性肝細胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，病理學上呈現為大泡性脂肪變性為主的混合性脂肪肝[2]。本課題前期研究表明，靈芝多糖能降低高脂性脂肪肝大鼠的血脂水平，提高自由基清除酶的活性，有效對抗氧化應激[3]。同時可下調大鼠主動脈活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平，抑制過氧化反應[4]。本實驗采用高脂飲食12周誘發(fā)大鼠非酒精性脂肪肝，模型組大鼠肝臟病理切片電鏡下觀察，可見肝細胞內充滿大小不一的脂滴，提示成功建立了大鼠NAFLD模型。用靈芝多糖預防給藥12周后，病理切片電鏡下觀察可見肝細胞超微結構明顯好轉，脂滴明顯減少，血清ALT和AST水平也顯著降低。

NAFLD的發(fā)病機制較復雜，迄今尚未完全闡明。胰島素抵抗是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[1]，隨著病情的發(fā)展，炎癥反應和氧化應激也參與到NAFLD的發(fā)病中。胰島素抵抗患者表現為脂肪細胞中TNF-α基因過表達和血中TNF-α含量增加。而TNF-α是眾多介導肝細胞損傷的脂源性炎癥因子中最重要的炎癥介質之一，肝臟是其重要的靶器官。與此同時TNF-α通過介導胰島素受體底物-1絲氨酸磷酸化，從而干擾細胞內胰島素與其受體結合后激發(fā)的信號傳遞，從而又引起胰島素抵抗[5]。近年發(fā)現脂聯素具有調節(jié)葡萄糖轉運、增加胰島素敏感性及抗炎癥等多種生物學效應。脂聯素與TNF-α均由脂肪細胞分泌，兩者結構相似，但發(fā)揮的生物學效應卻完全相反[6]。相關分析顯示脂聯素和TNF-α均與胰島素抵抗密切相關，兩者相互抑制，相互拮抗，共同參與NAFLD的形成[7]。本研究結果顯示靈芝多糖能夠降低大鼠血清TNF-α水平及上調血清脂聯素水平，改善胰島素抵抗，增加胰島素敏感性，起到防治NAFLD的作用。

PPAR γ主要介導脂肪細胞的分化與成熟，參與肝臟炎癥反應的發(fā)生與調控，在調節(jié)胰島素敏感性方面發(fā)揮著重要作用。PPAR γ活化后能使轉運至肝臟和肌肉的脂肪酸減少，脂肪合成降低，從而改善胰島素抵抗，抑制脂質代謝。PPAR γ激活后可以降低TNF-α基因表達，阻斷TNF-α在信號傳導途徑中對胰島素受體及胰島素受體底物磷酸化的抑制作用。同時PPAR γ能促進脂聯素基因轉錄，提高脂肪細胞產生和分泌脂聯素[8]?？梢奝PAR γ的生理作用與其調控TNF-α和脂聯素分泌有著密切聯系。本研究結果顯示，NAFLD模型組大鼠肝組織PPAR γ表達顯著降低，血清TNF-α水平明顯升高而脂聯素水平顯著下降。而靈芝多糖中劑量組、高劑量組PPAR γ表達顯著上調，說明靈芝多糖通過上調肝組織PPAR γ的表達，顯著改善胰島素抵抗，對NAFLD大鼠起到有效防治作用。COX-2是一種誘導酶，幾乎存在于所有細胞中，在正常大鼠肝臟中很少表達，而在許多炎癥因素的刺激下會誘導其高表達[9]，參與炎癥反應、腫瘤等多種病理過程。有研究證實COX-2表達下調可減輕肝臟脂肪變性程度與炎癥反應[10]。Ito等[11]發(fā)現COX-2抑制劑能相對減少TNF-α的產生。本實驗顯示NAFLD模型組大鼠肝細胞中充滿大小不等的脂滴，同時COX-2的表達量明顯升高，提示COX-2與NAFLD的發(fā)病存在相關性，并且COX-2參與了肝臟脂肪變性的過程。靈芝多糖能夠下調肝組織COX-2的表達，對NAFLD大鼠肝臟起到一定保護作用。

綜上所述，靈芝多糖能夠有效改善胰島素抵抗，減少炎癥反應發(fā)生，對NAFLD有較好的防治作用，其作用機制可能與上調肝組織PPAR γ以及下調COX-2的表達密切相關，這為靈芝多糖今后的進一步研究提供了理論依據和實驗基礎。

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