倪潤洲 ，肖明兵，江 楓，李小彥 ，鈕曉音

（1南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 226001；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海免疫學(xué)研究所）

膽胃寧是由經(jīng)典方大柴胡湯加減而成，在臨床上對膽汁反流性胃炎所致的胃黏膜病變有較好的療效。我們在先前的實驗中,證實膽胃寧對乙醇性胃黏膜損傷具有良好的修復(fù)作用。在胃黏膜損傷病變中，局部組織中炎癥因子改變起到重要的致病作用。目前在致炎因子的研究中，Th17型細(xì)胞因子是最新發(fā)現(xiàn)的一類前炎癥因子，包括IL-17、IL-21、IL-6等，它們在炎癥性疾病中起到關(guān)鍵的致病作用。本研究將通過膽胃寧對胃粘膜Th17型細(xì)胞因子濃度水平的誘導(dǎo)變化,闡明膽胃寧對胃粘膜炎癥的清除保護(hù)效應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步加深中藥治病機(jī)理的研究，為中藥現(xiàn)代化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：BALB/c小鼠，雌性，8周齡，共20只，由南通大學(xué)動物中心提供，許可證編號：SYXK(蘇)20002—002。(2)藥物與試劑 :膽胃寧由炒柴胡 10g、炒黃芩 10g、炒枳殼 10g、法半夏 10g、制軍8g、杭白芍 15g、廣郁金 12g、廣木香 10g(后下)、粉甘草3g、加水煎至100mL，由南通市中醫(yī)院制劑室提供。IL-17、IL-21、IL-6細(xì)胞因子的檢測抗體和標(biāo)準(zhǔn)品（R&D公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及標(biāo)本處理：（1）將 20只 BALB/c小鼠隨機(jī)分成生理鹽水組和膽胃寧組，每組10只。小鼠禁食24h、禁水2h后，以無水乙醇5mL/kg體重灌胃制作急性胃黏膜損傷模型。2h后生理鹽水組以15mL/kg生理鹽水灌胃。膽胃寧組以15mL/kg劑量灌胃治療，每隔3h后按以上方法重復(fù)灌胃，24h后用戊巴比妥麻醉剖腹取全胃。（2）小鼠麻醉后剖腹取胃，在胃相同部位切取組織塊0.5 cm×1.0 cm，稱重后制備組織勻漿，取上清液置-80℃保存。

1.2.2 ELISA 檢測：（1）包被：用 PBS 稀釋包被抗體monoclonal anti-mouse IL-17/IL～21/IL-6 antibody(capture antibody)，以100μL/孔加入 96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。（2）封閉：棄去包被抗體，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20洗滌3次，加入封閉液（PBS-1%BSA）200μL/孔，37℃孵育 1h。（3） 棄去封閉液，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20 洗滌 1 次，加入待測上清樣品和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品 50～100μL/孔，37℃孵育 1h。（4） 棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20洗滌3次，加入稀釋好的檢測抗體biotinylated anti-mouse IL-17/IL～21/IL-6 antibody（detect antibody）100μL 孔，37℃孵育 1h；（5）棄去檢測抗體，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20 洗滌 3 次，加入 Streptavidin-HRP 100μL/孔，37℃避光孵育 1h。（6） 棄 去 Streptavidin-HRP，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20洗滌3次，加入底物100μL/孔，37℃避光孵育 1h；（7）加入終止液：100μL/孔；（8）讀板：酶標(biāo)儀450nm波長處測OD值；（9）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本細(xì)胞因子濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在乙醇所致的急性胃黏膜損傷模型中，膽胃寧能夠明顯下調(diào)胃粘膜組織中Th17型細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-6的濃度水平（圖 1），其下調(diào)改變與胃粘膜保護(hù)作用相一致。胃黏膜中IL-6的濃度在膽胃寧組中為 6.30±2.15pg/mL，生理鹽水組為 10.27±1.80pg/mL；IL-21 的濃度在膽胃寧組中為 2.76±0.51pg/mL，生理鹽水組為 9.17±3.64pg/mL；IL-17 的濃度在膽胃寧組中為 14.52±3.30pg/mL，生理鹽水組為 30.49±3.56pg/mL。IL-21 和 IL-17 濃度的改變有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中炎癥因子IL-17濃度改變最為明顯，說明膽胃寧對胃黏膜中炎癥因子具有明確的下調(diào)保護(hù)作用。

圖1 膽胃寧下調(diào)胃粘膜Th17型細(xì)胞因子的濃度水平

3 討 論

膽胃寧是由經(jīng)典方大柴胡湯加減而成，組方包括炒柴胡,炒黃芩,炒枳殼,法半夏,制軍,杭白芍,廣郁金,廣木香,川厚樸,炒白術(shù),粉甘草。先前的182例臨床研究顯示它對膽汁反流性胃炎有顯著療效[1]。我們曾在乙醇所致的胃粘膜急性損傷動物模型中發(fā)現(xiàn)，膽胃寧組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)均顯著低于模型組，膽胃寧組胃黏膜損傷輕于雷尼替丁及硫糖鋁組。實驗顯示，膽胃寧能提高大鼠胃黏膜內(nèi)前列腺素PGE水平，降低丙二醛MDA含量。因此膽胃寧能夠通過降低脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化活力和促進(jìn)PGE合成來促使急性胃黏膜損傷的修復(fù)[2]。

Th17型細(xì)胞因子是一類最新發(fā)現(xiàn)的前炎癥因子，包括IL-17、IL-21、IL-6等，它們是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的，在炎癥性疾病中起到關(guān)鍵的致病作用[3-4]。Th17細(xì)胞是一群不同于Th1、Th2的CD4效應(yīng)T細(xì)胞，且在分化途徑和免疫調(diào)節(jié)方面，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）相互制約維持平衡[5]。最新研究顯示，在胃粘膜的急慢性炎癥中，以Th17型細(xì)胞因子為主的前炎癥因子在疾病的進(jìn)展中起到重要的促進(jìn)作用[6-7]。

中藥對免疫系統(tǒng)的作用影響一直是研究的熱點(diǎn)，但是在胃粘膜保護(hù)機(jī)制方面，還很少有人涉及。本實驗證明膽胃寧能夠通過對胃粘膜Th17型細(xì)胞因子濃度水平的誘導(dǎo)和改變，發(fā)揮對胃粘膜炎癥的清除保護(hù)效應(yīng)，明確了膽胃寧可通過免疫學(xué)機(jī)制下調(diào)胃黏膜炎癥反應(yīng)。

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