陳 靜

（廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180）

紫杉醇衍生物GT對人喉癌細胞系Hep-2的臨床價值分析

陳 靜

（廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180）

目的探討紫杉醇衍生物GT對人喉癌細胞系Hep-2的臨床價值。方法GT對Hep-2細胞的增殖抑制作用應用MTT法進行測定，通過流式細胞術及細胞形態(tài)學考察GT對Hep-2細胞誘導凋亡的作用。結果在光鏡下，GT作用細胞之后能觀察到較為典型的細胞凋亡的形態(tài)學變化，如染色質斷片化、細胞核固縮、核碎裂、染色質凝集成新月型緊貼于核膜周邊、凋亡小體形成等。明顯增加G2/M期的細胞比例，典型的亞二倍體“凋亡小峰”出現(xiàn)。結論紫杉醇衍生物GT能夠明顯抑制Hep-2細胞的生長，使細胞分裂阻滯于G2/M期，對腫瘤細胞凋亡有誘導作用，值得臨床進一步對其進行研究開發(fā)。

紫杉醇衍生物；GT；人喉癌細胞；Hep-2；價值；阻滯；抑制

紫杉醇是一種抗癌新藥，它從太平洋紫衫屬短葉紫衫莖皮中提取而得，在多種惡性腫瘤的臨床治療中已經(jīng)得到了應用。但是，在實際臨床應用中，由于其非常差的水溶性，大大限制了應用程度。所以，為了提高紫杉醇的水溶性，對其進行修飾，已經(jīng)成為目前紫杉醇研究的熱點。探討紫杉醇衍生物GT對人喉癌細胞系Hep-2的臨床價值，為今后的紫杉醇臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

紫杉醇(北京四環(huán)制藥廠批號∶ H20057878)，本院提供紫杉醇GT，DMEM(宜興市塞爾生物化學工廠批號：960819、960820、970320)，噻唑藍(MTT)(Amresco公司批號：0793)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所提供)。

1.2 細胞培養(yǎng)

本院提供人喉癌細胞系Hep-2，10%新生牛血清為培養(yǎng)液，100μg/mL鏈霉素、100U/mL青霉素，2mmol/LL-谷氨酰胺的DMEM溶液，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

1.3 藥液配制

稱取適量紫杉醇粉末和GT，DMSO溶解，然后進行過濾以除菌，應用DMEM進行稀釋處理，濃度以所需濃度為準，培養(yǎng)液中不超過0.5%的DMSO終濃度。

1.4 形態(tài)學觀察

6×105個Hep-2細胞接種于10mL培養(yǎng)瓶中，給予24h的5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，然后更換為含有800nmol/L和80nmol/L的GT的培養(yǎng)液，應用顯微鏡分別觀察作用24h、48h、72h后的細胞變化情況，用Giemsa于各時間點進行染色，并在顯微鏡下對細胞形態(tài)進行觀察。

1.5 細胞增殖抑制實驗

按照4×103/mL密度，于96孔板中接種Hep-2細胞，放置在37℃條件下，每孔200μL，進行24h培養(yǎng)之后，加入20μL不同濃度GT藥液，分別達到1600nmol/L、800nmol/L、160nmol/L、64nmol/L、32nmol/L、6.4nmol/L、3.2nmol/L的終濃度，每種濃度平行4孔，同時設陽性對照組和陰性對照組，陽性對照組即紫杉醇組，陰性對照組含0.5%DMSO的DMEM。分別加入20μL MTT(5mg/mL)于加入藥液24h、48h及72h后，繼續(xù)進行4h的37℃培養(yǎng)，棄上清，紫色結晶加100μL酸化異丙醇(0.04%HCL)溶解。D值在酶標儀上進行測定，參考波長為630nm，測定波長為570nm。

1.6 流式細胞儀分析

6×105個Hep-2細胞接種于10mL培養(yǎng)瓶中，進行24h的5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)之后，更換為含有6.4nmol/L、80nmol/L、和800nmol/L的紫杉醇或GT培養(yǎng)液，分別給予48h作用之后，用胰酶消化并收集細胞，0.7mL無水乙醇加入含5%～10%小牛血清0.3mL的PBS懸浮，進行24h以上的-20℃固定細胞。進行30s的3000r/min離心之后，棄上清，2次PBS洗之后，進行30min 37℃溫育，沉淀用100μLRNAase(1mg/mL)懸浮，加碘化丙啶400μL(PI，50μg/mL)，放置到暗處，10min后上機檢測。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)觀察

進行24h的GT處理之后，細胞折光性增強，并開始變圓。漂浮細胞的比例隨時間延長而增加，部分細胞漂浮、皺縮于48h后出現(xiàn)。低濃度作用的細胞在72h之后還有少數(shù)貼壁，而72h后高濃度藥物作用的細胞全部漂浮。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Giemsa染色后藥物作用組細胞發(fā)生凋亡，其特征主要表現(xiàn)為細胞染色質濃縮，核碎裂，斷裂的染色質彌散于胞漿內(nèi)，形成粗細不勻的顆粒，細胞膜出泡，碎裂核被部分細胞膜包裹形成凋亡小體(圖1)。

圖1 GT作用后Hep-2細胞形態(tài)的變化

2.2 GT對Hep-2細胞的增殖抑制作用

對Hep-2細胞，GT和紫杉醇均具有明顯的生長抑制作用，其抑制率在相同濃度條件下隨作用時間的延長而增加；抑制率在相同作用時間下隨藥物濃度的升高而增加，其關系呈現(xiàn)為劑量依賴和時間依賴。各個時間點相比較，GT和紫杉醇的抑制率都沒有顯著性差異(P＞0.05)，表明二者具有相當?shù)募毎拘浴?/p>

3 討 論

紫杉醇是一種具有獨特抗癌活性的天然藥物，在當今抗癌藥物研究中已經(jīng)成為熱點[1]。但是，紫杉醇的特點是毒性大、水溶性差，從而限制了其使用范圍，導致了紫杉醇注射制劑存在許多不足。紫杉醇水溶性能夠通過化學修飾而改善，從而達到增強臨床治療效果、降低毒副作用的目的。

本組研究中，引入了極性很大的胍丁胺基團，大大提高了紫杉醇衍生物GT水溶性。在對Hep-2細胞的增殖抑制實驗中，細胞毒性GT和紫杉醇相當，這表明在胞內(nèi)2'-羥基酯鍵可斷裂，將原藥紫杉醇釋放出來，對其細胞毒性基本不造成影響。在光鏡下經(jīng)Giemsa染色發(fā)現(xiàn)，GT作用組細胞出現(xiàn)凋亡特征：斷裂的染色質彌散于胞漿內(nèi)，形成組粗不均勻的顆粒，核碎裂，細胞染色質濃縮，細胞膜出泡，碎裂的核被部分細胞膜包裹而形成凋亡小體；在誘導細胞凋亡實驗中，發(fā)現(xiàn)低濃度GT比高濃度GT更容易，其主要原因可能是過高的藥物濃度，逐漸增多了壞死細胞。誘導細胞凋亡從凋亡角度看，應選擇合適的作用時間和藥物濃度，才可以啟動癌細胞的“自殺”程序，同時又避免了正常細胞因超長作用時間和藥物過大劑量而受損。通過本組研究，表明胍丁胺基團在化學修飾紫杉醇的過程中，增強了其水溶性，且對其抗腫瘤活性也并未改變，值得臨床作進一步的研究開發(fā)[2-5]。

[1] 刁志花,龔偉,尤勇,等.紫杉醇衍生物對人喉癌細胞系Hep-2的抑制作用[J].軍事醫(yī)學科學院院刊,2009,30(4)∶337-339.

[2] 王江華,司徒鎮(zhèn)強,吳軍正,等.紫杉醇對人粘液表皮樣癌細胞系的細胞毒研究[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2009,17(1)∶112-114.

[3] 趙世義,馬力,王祥.紫杉醇誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡的實驗研究[J].腫瘤防治雜志,2009,9(3)∶257-259.

[4] 杜文婷,胡永洲.紫杉醇水溶性衍生物的研究進展[J].中國現(xiàn)代應用醫(yī)學,2009,2(1)∶304-305.

[5] 呂衛(wèi)兵,陳小義,徐瑞成,等.水溶性紫杉醇衍生物PLT抗腫瘤活性的實驗研究[J].天津醫(yī)藥,2009,37(3)∶294-295.

Clinical Value of Taxol Derivative GT on Human Laryngeal Carcinoma Cell line Hep-2

CHEN Jing

(Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou 510180, China)

ObjectiveTo investigate the clinical value of taxol derivative GT on human laryngeal carcinoma cell line Hep-2.MethodsGT inhibited the proliferation of Hep-2 cell by MTT method were determined by morphology, flow cytometry and the effects of GT on apoptosis of Hep-2 cells induced by.ResultsUnder light microscope, GT cells can be observed in the typical morphological changes of apoptosis, such as chromatin fragment, cell shrinkage, nuclear fragmentation, chromatin condensation integrated crescent clings to the nuclear periphery, the formation of apoptotic bodies. Increased G2/M phase cells proportion, " typical hypodiploid apoptosis peak appeared small ".ConclusionTaxol derivative GT can obviously inhibit the growth of Hep-2 cells, the cell division arrest in G2/M phase, in inducing the apoptosis of tumor cells, which is worthy of further research and development of the.

Taxol derivatives; GT; Laryngeal squamous cell carcinoma; Hep-2; Value; Block; Inhibition

R739.65

B

1671-8194（2013）13-0027-02