姜金玉 鄭賢軍 孔高茵 張 宇

（湖南省人民醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410005）

氯胺酮對(duì)重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠NF-κB的影響

姜金玉 鄭賢軍 孔高茵 張 宇

（湖南省人民醫(yī)院麻醉科，湖南 長沙 410005）

目的 探討氯胺酮對(duì)重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠NF-κB的影響。方法 60只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組，SAP組和氯胺酮干預(yù)組（KTM組），每組20只。應(yīng)用逆行胰膽管泵注5%?；悄懰徕c誘導(dǎo)大鼠重癥急性胰腺炎。氯胺酮干預(yù)組術(shù)后腹腔給予4mg/kg氯胺酮。造模后12h檢測(cè)肺濕重干重比，肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒細(xì)胞百分比，并應(yīng)用原位雜交法檢測(cè)造模后6h，12h肺組織NF-κB p65mRNA的表達(dá)。結(jié)果 NF-κB p65mRNA在SAP時(shí)除肺泡的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)外，出現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，隨時(shí)間的延長表達(dá)逐漸增加，KTM組NF -κB p65mRNA的表達(dá)明顯下降。結(jié)論 NF-κB活化與SAP的肺損傷密切相關(guān)，氯胺酮可以通過抑制NF -κB p65mRNA的表達(dá)起到肺保護(hù)作用。

胰腺炎；核因子-κB；氯胺酮

急性肺損傷（ALI）甚至急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是重癥急性胰腺炎（（Severe acute pancreatitis，SAP）常見并發(fā)癥，尤其是繼發(fā)感染時(shí)，ALI/ARDS具有相當(dāng)高的病死率[1,2]。潛在的機(jī)制是復(fù)雜的，知之甚少。目前認(rèn)為SAP實(shí)際上是一種嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），炎性介質(zhì)的失控性釋放是造成SIRS的主要原因[3]。本實(shí)驗(yàn)探討NF-κB在急性重癥胰腺炎肺損傷發(fā)病中的作用及氯胺酮對(duì)其的干預(yù)效用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

?；悄懰徕c購自Sigma公司，NF-κBp65mRNA 原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，氯胺酮由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，SD大鼠由湖南省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

健康成年（10～12周齡）雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～250g。所有SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為3組，A組：對(duì)照組；B組：SAP組；C組：氯胺酮干預(yù)組，每組20只。

1.2.2 SAP模型制備

術(shù)前所有SD大鼠術(shù)前禁食12h，自由飲水。麻醉采用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射。麻醉后仰臥位固定，術(shù)野備皮，消毒鋪單。模型組上腹部正中切口，暴露十二指腸、胰膽管和膽總管，用小動(dòng)脈夾夾閉靠近肝門的胰膽管，在手術(shù)顯微鏡下，將直徑大約0.45mm的聚乙烯導(dǎo)管緊貼胰膽管匯入十二指腸處置人胰膽管，再用小動(dòng)脈夾將遠(yuǎn)端也夾閉。用GRASBY 3500微量注射泵逆行泵入5%?；悄懰徕c（1mL/kg，0.04mL/min），泵注完畢2～3min后即可見胰腺充血、水腫，胰膽管及主胰管擴(kuò)張， 泵注完畢后保持壓力10min后拆線，并退出導(dǎo)管，創(chuàng)面封閉膠封閉穿刺孔，撤除小動(dòng)脈夾，將腸管還納復(fù)位后關(guān)腹[4]。對(duì)照組為假手術(shù)組，開腹僅翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹。

1.2.3 氯胺酮干預(yù)實(shí)驗(yàn)

氯胺酮干預(yù)組術(shù)畢腹腔內(nèi)注射氯胺酮4mg/kg（生理鹽水稀釋成1mL），對(duì)照組與SAP組手術(shù)后腹腔內(nèi)注射生理鹽水1mL。

1.2.4 肺濕干重比

每組10只于造膜12h后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，放血處死，開胸取左肺組織稱濕重（W）后將標(biāo)本置于80℃電熱干燥箱內(nèi)烘烤48h，然后稱干重（D），肺濕干重比=W/D。

1.2.5 肺泡灌洗液（BALF）中中性粒細(xì)胞百分比與蛋白含量

處死動(dòng)物前，夾閉左主支氣管，經(jīng)右支氣管肺泡灌洗，回收率為90%，將肺泡灌洗液3000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。取沉淀物用Giemsa染色后光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，計(jì)算中性粒細(xì)胞百分比。

1.2.6 肺組織NF-κB p65Mrna

每組余下的10只SD大鼠中5只于術(shù)畢6h，另5只于術(shù)畢12h取右肺上葉組織用4%多聚甲醛、0.1%DEPC固定液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片。應(yīng)用NF-κBp65mRNA原位雜交試劑盒檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺W/D、BALF中蛋白含量和中性粒細(xì)胞百分比的變化

對(duì)照組大鼠肺W/D為（4.52±0.28）；SAP組（6.42±0.25）與KTM組（5.58±0.19）的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。SAP組大鼠BALF中蛋白含量和中性粒細(xì)胞百分比對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），KTM組與SAP組對(duì)比，BALF中蛋白含量和中性粒細(xì)胞百分比明顯下降（P＜0.01），見表1。

表1 各組肺W/D、BALF蛋白含量和中性粒百分比的變化（）

表1 各組肺W/D、BALF蛋白含量和中性粒百分比的變化（）

與對(duì)照組相比，★P＜0.01；與SAP組相比，$P＜0.01

BALF中性粒百分比（%）對(duì)照組4.52±0.280.15±0.02822.56±8.45 SAP組6.42±0.25★0.68±0.045★78.85±9.680★KTM組5.58±0.19★$0.48±0.075★$56.72±10.63★$組別肺W/DBALF蛋白含量（ g/L）

2.2 肺組織中NF-κBp65mRNA的表達(dá)

NF-κBp65mRNA在對(duì)照組部分肺泡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)，而在細(xì)胞核內(nèi)未見表達(dá)。SAP組除肺泡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)外，出現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。用圖象分析儀測(cè)量細(xì)胞胞漿內(nèi)陽性反應(yīng)物的平均吸光度值（A），SAP組與對(duì)照組相比有顯著性差異，（P＜0.01），KTM組與SAP組比較，NF-κBp65mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.01） （表2）。

表2 NF-κB p65mRNA在各組大鼠肺組織中的表達(dá)

3 結(jié) 論

已證實(shí)核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB （NF-κB）在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控多種炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并參與了SAP炎性介質(zhì)的調(diào)控[5]。NF-κB通常以由NF-κB/Rel家族組成的同源或異源復(fù)合物形式存在，其中最常見的為p65/p50異二聚體，也是其活性的主要形式[6]。Kan[7]等研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的激活可能是通過調(diào)節(jié)iNOS mRNA表達(dá)參與SAP肺損傷。Jaffray[8]等研究發(fā)現(xiàn)胰彈性蛋白酶誘導(dǎo)的細(xì)胞因子介導(dǎo)的肺損傷，這種途徑是以NF-κB作為第二信使發(fā)揮作用。NF-κB的激活可促進(jìn)多種炎性遞質(zhì)在SAP時(shí)過度表達(dá)，引起胰腺和胰外組織器官損傷。最近的數(shù)據(jù)表明氯胺酮有抗炎[9]作用。然而，氯胺酮誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)[10]機(jī)制則知之甚少。在這項(xiàng)研究中，我們采用?；悄懰徕c制作大鼠急性壞死性胰腺炎模型，重點(diǎn)觀察氯胺酮在肺損傷發(fā)生時(shí)對(duì)NF -κB的影響。研究氯胺酮的免疫調(diào)節(jié)作用是否與NF-κB有關(guān)。研究結(jié)果表明：SAP組大鼠BALF中蛋白含量和中性粒細(xì)胞百分比對(duì)照組明顯升高，NF-κBp65mRNA在肺組織中的表達(dá)也明顯增加，其表達(dá)亦隨造模時(shí)間的延長而增強(qiáng)。說明SAP肺損傷與NF-κB的激活有關(guān)。KTM組與SAP組對(duì)比，肺濕干重百分比、肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒百分比均降低，可能是通過下調(diào)NF-κB p65mRNA的表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。

總之，在這項(xiàng)研究中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)的抑制可以解釋一些與氯胺酮治療相關(guān)的免疫抑制作用，如減少吞噬細(xì)胞表面受體和降低炎性細(xì)胞因子的生成等。但氯胺酮抑制NF-κB的信號(hào)途徑需進(jìn)一步闡明。此外，對(duì)于其他轉(zhuǎn)錄因子的影響還有待研究。

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1671-8194（2013）24-0069-02